CACNA1F基因在3T3L1脂肪细胞诱导分化过程中表达变化的研究

1、CACNA1F基因在3T3().()5),其余各时间 段之间的表达水平差异均有显著性(PV().()5)。结论CACNA1F基因参 与了脂肪细胞分化的调控，与肥胖发生相关，其在3T3-L1细胞分化过 程中的表达变化可能有利于脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚。【关键词】CACNA1F基因3T3-L1前体脂肪细胞细胞分化.Abstract Objective To investigate the changes of L-type voltagc-depcndcnt calcium channel al F(CACNA1 F)gcnc expression during 3T3-L1 preadipo

2、cyte diffcrcntiation.To explore the relationship butwexnCACNA1F gene and the etiology of obesity.Methods 3T3-L1 preadipocytes were cultured in vitro and differentiated into the matured adipocytcs.Total RNA was extracted from adipocytes of various times and the levels of CACNA1F gene mRNA expression

3、were evaluated by RT-PCR-Rcsults In preadipocyc, the levels of CACNA1F gene mRNA expression remained at low.In the presence of inducing reagents, the CACNA1F gene mRNA expression was induced at a very early stage and remained at high levels in the mature adipocytc.Thcre was a significant difference

4、between any two detected phases in the levels of CACNA1F gene mRNA expression，except that the levels of CACNA1F gene mRNA expression did not increase obviously in day 0 to 3 day, 5th to 6th day, Sth to l()th day.Conclusion CACNA1F gene is involved in the differentiation of adipocytes and related to

5、the etiology of obesity .Thu changes in the level of CACNA1F gene mRNA expression during 3T3-L1 preadipocyte differentiation might be contributing to the differentiation and adipogcncsis of adipocytes.Key words L-typc voltage-dependent calcium channel alF gene 3T3-L1 preadipocyte cell differentiatio

6、n近年来，我国儿童肥胖的发病率逐渐上升，而且与肥胖相关的一些疾病，如高血压、高脂血症、2型糖尿病等越来越多地出现在儿童群体中，肥胖已成为危害儿童身心健康的严重医学问题；然而肥胖病 因复杂，是机体在遗传、环境、行为、生理、社会、文化等诸多因素 相互作用下能量代谢失衡的结果，因此防治难度极大，一些传统的肥 胖治疗方法如控制饮食、减肥药物等收效甚微，而且由于儿童正处于 身心发育的关键时期，这些方法在儿童中的应用受到限制，因此迫切 需要寻找安全有效的肥胖控制治疗方法。钙是饮食中一种重要的成分, 自从十多年前人们发现肥胖病人体内脂肪细胞中钙离于浓度升高以 来，钙与肥胖的关系逐渐成为一个研究热点，为寻找控

7、制肥胖及其相 关疾病的治疗方法开拓了一片崭新的视野。研究表明，细胞内钙离于 浓度在与肥胖相关的能量代谢失衡中起关键作用。细胞内钙离于在调 控脂肪细胞脂质代谢和甘油三酯沉积中起着重要作用，细胞内钙离于 浓度的增加导致脂肪合成基因的表达和脂肪合成的增加、抑制脂肪分 解，最终增加脂肪积聚而导致肥胖。低钙饮食可导致1, 25-二轻维生 素D3的产生增加，刺激钙离子在细胞内流动从而促进肥胖的发生； 而髙钙饮食可以减少脂肪细胞脂质积聚，增加脂质分解，控制体重增 加1, 2。在这个过程中，钙离于通道介导的钙离子细胞内流是一个 重要环节。因此围绕着钙离于通道及其调控因素开展进一步的研究具 有重要的意义。由于在

8、先前研究中3,应用cDNA array技术发现， L 型电压依赖钙离于通道ocl F(L-typc voltagc-dcpcndcnt calcium channel a IF, CACNA1F)基因差异表达于肥胖和正常大鼠的脂肪组织中，肥胖 状态下该基因表达显著上调，提示该基因表达变化与肥胖发生密切相 关。为进一步研究该基因与肥胖之间的关系，本研究在成功诱导 3T3-L1前体脂肪细胞分化成熟的基础上，采用RT-PCR技术观察CACNA1F基因在前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化过程中表达水平 的变化，以探讨该基因与脂肪细胞分化及肥胖之间的关系。1材料与方法1.1材料3T3-L1前体脂肪细胞株由上

9、海中科院生物化学与细胞 生物学研究所廖侃教授馈赠，本实验室传代留种，OMEM培养基、胰 蛋白酶、TRIzol购自美国liwitrogun公司,胎牛血清(任切bovine scrum, FES)购自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰岛素、地塞米松、1- 甲基-3-异丁基黄瞟吟(MIX). DEPC购自美国Sigma公司，油红()(oil wd-()染料购自上海化学试剂厂。dNTP、M-MLV逆转录酶、 ()ligo(dT)18 Ex-Taq酶等分于生物学试剂购自美国Promega公司，PCR Marker购自华美生物工程公司，引物由上海捷倍思基因技术有限公司 合成。1.2方法1.2.1 3T3-

10、L1前体脂肪细胞培养和诱导分化根据3T3-L1细胞培 养和诱导分化方案4,用完全培养液(DMEM+l()%FBS+l()()u/ml 链霉素)，在37C孵箱(5%二氧化碳，95%空气中培养细胞，每2天换 液1次。待细胞生长至完全融合后2天(第()天)，开始诱导分化，具体 步骤为：将培养液换成含().5mmol/L MIX. lmol/L地塞米松和5mg/L 胰岛素的完全培养液；48h后，撤去MIX和地塞米松，使完全培养液 中只含有5mg/L胰岛素；2天后换液，撤去胰岛素，使用不含有任何 诱导剂的完全培养基；以后每2天换液1次，直至第1（）天95%以上细 胞已分化为成熟的脂肪细胞。收集分化不同时

11、间段（0-10天）的细胞， 置-7（）C冻存备用。1.2.2 3T3-L1细胞鉴定油红（）染料经异丙醇溶解后过滤，置4C 备用。取分化不同时间段（010天）的细胞,先用0.01 M PBS洗2遍， 加入3.7%甲醛固定2min,再用清水洗净，加入油红（）染液染lh,水 洗至背景透明。经油红（）染色、苏木素复染，显微镜下观察结果，细 胞质中脂滴呈亮红色、细胞核呈蓝色。拍照，记录细胞的分化情况。1.2.3 RT-PCR方法检测3T3-L1细胞中CACNA1F基因mRNA的 表达水平 取细胞20（1（4X105个细胞），TRizol法提取3T3-L1细胞 的总RNA,定量后取gg,以Oligo（dI

12、018为引物进行逆转录，反应体 系20ulo取逆转录产物1卩1为模板进行PCR扩增，PCR反应体系20。 小鼠CACNA1F基因的上游引物序列：5 -ATC ATC ATC TTC TCC CTG CT-3,下游引物序列：5 -CAC CAC ATG CTT GAG TCC CT-3, 产物长度987bp;内参照小鼠GAPDH基因的上游引物序列：5 -ACC ACAGTCCATGCC ATC AC-3,下游弓 | 物序列：5 -TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3,产物长度432bp。PCR反应条件为：预变性95C 2min,变性 94C 30s,退火 52C 3（）s（G

13、APDH 基因：52C 30s）,延伸 72C 3()s,共3()个循环(GAPDH基因：3()个循环)，终末延伸72C 5mino 所选用PCR反应的模板量及循环数均使PCR产物量位于反应曲线的 线性范围内。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，用UVP凝胶密度 扫描仪对CACNA1F基因和CAPDH特异性扩增产物的电泳条带进行 密度扫描，用Labwork 3.()软件测定电泳条带密度值，CACNA1F基因 mRNA的表达水平以该基因条带密度占GAPDH基因条带密度的百分 比()表示。1.3统计学方法 数据均以均数土标准差(x 土 s)表示，用Excel统 计软件和SPSS 10.0统计软件

14、进行数据整理和统计。多组间均数比较采 用方差分析F检验，组间两两比较采用q检验，PV0.05示结果具有统 计学意义。2结果2.1细胞染色鉴定结果诱导分化前，3T3-L1前体脂肪细胞呈梭 形成纤维细胞形态，细胞核呈蓝色，细胞质内未见亮红色颗粒；细胞 生长至完全融合后2天(第()天)开始诱导分化，第2天到第6天细胞形 态发生明显变化，细胞逐渐由梭形变为圆形，胞体变大变圆，细胞质 内被油红()染成亮红色的脂滴逐渐增多增大；第6天时，约6()%的细 胞已分化成熟；第1()天时，可见含有亮红色脂滴的成熟脂肪细胞在视 野中占95%以上，细胞体积大、形态圆。2.2 3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中CACNA1F基因表达水平的 变化 见图1、图2、表1。由图表可见，CACNA1F基因在脂肪前体细 胞中表达水平较低，随着脂肪细胞的分化成熟该基因表达水平逐渐升 髙，至分化第81()天达到高峰。进一步的统计分析发现，CACNA1F 基因的表达水平在细胞分化第()3天、56天、81()天3个时间段 内无明显变化外(P0.05),其余各时间段之间的表达水平差异均有显 著性(PV0.O5)。图1 3T3-L1脂肪细胞分化中CACNA1F基因表达水平的检测(M：PCRMarkers, 010：细胞分化时间)图2 3T3-L1脂肪细胞