视瞻昏渺发病机理与VEGFbFGFPEDF表达

1、视瞻昏渺发病机理与VEGF、bFGF、PEDF表达【摘要】 目的：观察脉络膜新生血管（CNV）动物模型视网膜色素上皮至脉络膜之间细胞因子VEGF、bFGF、PEDF表达的变化。方法：用半导体激光光凝建立CNV动物模型，于造模后1 w，2 w，3 w，4 w，8 w分别行免疫荧光检查（FFA）；于造模后8 w处死动物行HE染色观察视网膜和脉络膜的病理组织学变化，免疫组化法检测VEGF、bFGF、PEDF表达。结果：HE染色可见脉络膜新生血管形成。造模后模型组VEGF、bFGF上调，VEGF/PEDF值升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）；PEDF值轻度上调，与正

2、常对照组比较差异无统计学意义（P0.05）。结论：半导体激光可诱导CNV动物模型，该模型可做为视瞻昏渺的动物模型进行实验研究。 【关键词】 视瞻昏渺；脉络膜新生血管；新生血管内皮细胞生长因子；碱性成纤维细胞生长因子；色素上皮衍生因子年龄相关性黄斑变性（AMD）属于祖国医学“视瞻昏渺”范畴，本病随年龄增长，其发病率亦逐年升高。导致患者视力丧失的主要原因是继发于渗出型年龄相关性黄斑变性（ESMD）的脉络膜新生血管（CNV）。本病发病机理尚不明确, 治疗十分困难。研究显示，CNV的发生、发展和血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、碱性

3、成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）等密切相关。因此,我们从基础实验研究着手，建立相关动物模型,对VEGF、bFGF、PEDF进行研究,以期探索本病的发病机理，为寻求有效的治疗方案奠定实验基础。 1 材料与方法 1.1 实验材料 成年青紫蓝兔12只（约6月7月龄），普通级，体重（2 500±20）g。 1.2 实验方法 1.2.1 造模方法 12只青紫蓝兔随机分为正常对照组和模型组两组，每组6只。模型组以0.5%美多丽P滴眼液双眼散

4、瞳，0.4%倍诺喜行眼表麻醉后,在全视网膜镜下用半导体激光（波长532 nm）于视乳头下方作视网膜光凝。照射部位位于视乳头及髓线下方，以光凝后有气泡产生为击破Bruch膜的标志 1。激光参数：功率625 mW750 mW，时间0.1 s，光斑直径50 m，点数40点。 1.2.2 观察指标与检查方法 于造模后1 w，2 w，3 w，4 w，8 w行FFA检查。造模后8 w处死动物，取动物眼球置于10%中性福尔马林液中，将固定好的眼球去除多余组织，留取激光斑部位眼球壁组织，正常对照组留取相应部位组织，常规石蜡包埋、切片，行HE染色。VEGF、bFGF、PEDF免疫组化染色用SP法，光学显微镜下观

5、察视网膜和脉络膜组织学变化。造模8 w后采用Mias-2000型图象分析系统测定VEGF、bFGF及PEDF阳性表达。 1.3 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件，组间比较采用t检验。 2 结 果 2.1 HE、VEGF、bFGF与PEDF染色结果 结果见图1。 由图1可以看出，HE染色正常对照组可见视网膜、脉络膜的各层结构整齐，细胞结构正常。视网膜各层细胞着染正常，未见坏死、出血等结构改变。视网膜神经纤维层排列完整，细胞排列致密，内核层无碎裂及细胞核减少，椎杆体细胞排列整齐，色素上皮细胞排列紧密；脉络膜结构完整，各层细胞着染正常。模型组可见视网膜神经节细胞不同程度减少，内颗粒层和外颗粒

6、层结构不清，激光斑处色素上皮层基本消失，视网膜、脉络膜黏附在一起，激光斑下可见成纤维细胞，其中可见CNV，其血管管径较小，血管壁内皮细胞核肿胀，较圆。正常对照组视网膜色素上皮至脉络膜之间VEGF、bFGF、PEDF阳性表达较少，呈颗粒状；模型组阳性表达较多，呈密集的颗粒状及条带状，激光斑两侧视网膜脉络膜VEGF、bFGF、PEDF阳性表达较集中。视网膜色素上皮至脉络膜之间有棕黄色的颗粒，为bFGF阳性表达。正常对照组bFGF阳性表达较少，呈颗粒状；模型组阳性表达较多，呈密集的颗粒状及条带状，激光斑两侧视网膜脉络膜bFGF、bFGF、PEDF阳性表达较集中。 2.2 VEGF 、bFGF及PED

7、F 阳性表达与VEGF/PEDF结果比较 结果见表1。由表1可见，造模后8 w与正常对照组比较，模型组VEGF、bFGF上调（P<0.01），PEDF值轻度上调，VEGF/PEDF值升高（P<0.01）。 3 讨 论 早在诸病源候论中已有“目暗不明候”和“目茫茫候”的记载。证治准绳在论述视瞻昏渺时曰：“若人年五十以外而昏者，虽治不复光明，其时犹月之过望，天真日衰，自然目光渐谢”；证治准绳·七窍门中亦有云：“谓目内外别无证候，但自视昏渺，蒙昧不清也。”目前本病尚无专门的动物模型，CNV是渗出型年龄相关性黄斑变性的主要临床表现和致盲因素，因此可将CNV动物模型

8、作为视瞻昏渺实验研究的基础。 有学者提出CNV的发生首先是蛋白酶被激活，蛋白酶溶解了血管基底膜和周细胞外质的蛋白，使之水解，微血管内皮细胞通过血管基底膜浸润、迁移进入临近细胞外间质形成新生血管芽，这些新生血管芽穿过破裂的Bruch膜向色素上皮下生长，进一步侵犯神经上皮层，久之形成网状结构的新生血管膜。本实验HE染色结果显示，激光斑处的色素上皮层断裂，为CNV的发生创造了前提条件，激光斑处可见管径狭窄、内皮细胞核圆的新生血管。 脉络膜新生血管的发生机制尚未十分明了，一般认为是多种因素共同作用的结果。其病理基础是视网膜脉络膜局部的缺血缺氧，造成脉络膜微循环障碍及视网膜色素上皮功能异常，同时激发了各

9、种因子的活性，打破了多种因子间的平衡。在血管新生的调控机制上，受到血管新生促进因子和抑制因子的调控，正常情况下，血管新生的诱导与抑制处于平衡状态，两种因子的平衡使血管处于正常的生长状态，一旦此平衡打破，就会激活血管系统发芽长出新生血管 2。VEGF和bFGF是血管新生的主要诱导因子，二者有协同作用。目前普遍认为视网膜内VEGF过度表达是引起视网膜内及视网膜下新生血管形成的重要因素。本实验用高能量、短曝光时间、小光斑的半导体激光诱发CNV模型，造成光凝部位局部的炎症和缺血缺氧，而VEGF、bFGF免疫组化染色亦显示模型组阳性表达高于正常对照组。据此推断，半导体激光诱发CNV动物模型是通过VEGF

10、、bFGF的上调实现的，bFGF的表达与VEGF的表达走势一致，二者起协同性作用促进血管新生。 PEDF属于丝氨酸蛋白酶抑制超家族成员。PEDF最初是作为一种神经营养因子被发现和认识的，进一步研究发现PEDF除具有神经营养作用外，还具有抑制血管生成的功能。体外培养人正常ARPE-19细胞和CNV-RPE细胞，分别检测PEDF及其他血管生成抑制因子的浓度，发现PEDF及这些血管生成抑制因子并不如其他文献所报道的降低下调，而是明显上调 3。这可能与CNV晚期PEDF参与抑制其形成有关4。PEDF与VEGF之间的失衡在CNV形成中有重要意义。PEDF在晚期CNV的视网膜色素上皮细胞中有高度上调的表达

11、，抑制CNV的发展 5。 兔眼半导体激光光凝后，动物实验的CNV模型在FFA检查时可见明显的荧光渗漏，HE染色可见CNV形成，免疫组化VEGF、bFGF、PEDF检查均有相应的阳性表达，这种表现与ESMD发生的CNV在影像学及病理组织学方面均有相近之处，因此，可将此模型作为视瞻昏渺进一步实验研究的基础。【参考文献】 1Dobi E T，Puliafito C A，Destro M A new model of experimental choroidal neovascularization in the ratJ. Arch Ophthalmol，1989，107（2）：264-269.2金惠铭，卢建，殷莲华.细胞分子病理生理学M.郑州：郑州大学出版社，2002：267.3邓鑫，周希瑷.色素上皮衍生因子（PEDF）的研究进展J.临床眼科杂志，2005，13（1）：377-380.4Martin G，Schlunck G，Hansen L L，et al.Differential expression of angioregulator