绝经后退行性脊柱滑脱椎体软骨终板内雌激素受体表达与青年女性的差异

1、绝经后退行性脊柱滑脱椎体软骨终板内雌激素受体表达与青年女性的差异【摘要】 目的：探讨雌激素受体（ER）在绝经后退行性脊柱滑脱（DS）软骨终板内的表达及其意义。方法：用RTPCR方法检测绝经后DS与绝经前年轻女性正常腰椎(N)的软骨终板内ER mRNA的表达；Western blot方法检测绝经后DS与N的软骨终板内ER蛋白质的表达；用免疫组织化学法（Envision法）检测绝经后DS与N的软骨终板内ER的分布和表达，测定绝经后DS患者血液中雌激素浓度；分析雌激素、ER和DS之间的关系。结果：ER mRNA的表达量在绝经后DS的软骨终板中较N明显下降（P<0.05）；绝经后DS的软

2、骨终板中ER蛋白质的表达量较N明显下降（P<0.05）；免疫组织化学结果显示ER在绝经后DS的软骨终板中仅少量表达，在N的软骨终板中表达量较强；绝经后DS患者血液中雌激素浓度明显下降。结论：女性在绝经后体内雌激素下降，软骨终板中ER表达量较N显著下调，可能是引起绝经后女性DS高发的原因之一。 【关键词】 雌激素受体 退行性脊柱滑脱 软骨终板 脊柱不稳是指在脊柱结构丧失维持其自身生理平衡位置的能力，导致脊柱节段间位移超出其生理限度对于承载的异常反应。最常见的为退行性腰椎不稳，长期的不稳逐渐发展为退行性脊柱滑脱（degenerative spondylolishesis DS）。DS

3、是一种独特形式的椎体滑脱，为神经孔完整的进展性椎体滑移1。然而，DS的病因还不清楚。在过去几十年中，大多数研究仅强调了关节突关节形态的异常23，但Love等4指出小关节角度的增加是小关节炎重建的结果，而不是DS的起始病因。 DS多见于女性，在40岁以前一般不发病，绝经后发病率显著升高。这表明雌激素在DS发病中可能有潜在作用。Richmond等5发现成人软骨细胞中有雌激素受体（ER）、ER的mRNA表达和ER蛋白的存在，说明软骨是雌激素敏感性组织。女性绝经后体内雌激素水平下降，下调ER的表达，可能是绝经后妇女高发DS的原因之一。 本研究对成年女性软骨终板上ER进行检测,比较绝经前后软骨终板上ER

4、的表达情况，旨在阐明雌激素及其受体在DS中的可能作用。 1 材料与方法 1.1 标本来源 取2006年4月 2006年8月期间东南大学附属中大医院骨科因DS行椎间植骨融合椎弓根钉内固定术的绝经后患者共18例，术中用刮勺刮取软骨终板（不包括骨性终板和软骨下骨）作为实验组，同期本校解剖教研室取新鲜女性尸体软骨终板18例作为对照组。所有标本保存于-80 待提取RNA及蛋白质。记录患者和尸体的体重、年龄和体重指数。以人群绝经前妇女血液中平均雌激素浓度作为对照组，测患者术前清晨空腹血液中雌激素浓度作为实验组。 1.2 主要试剂 兔抗人ER抗体（Abcam公司，英国），羊抗兔第二抗体（南京大治生物有限公司

5、），显色试剂DAB（北京中杉生物有限公司）。TRNzol总RNA提取试剂盒（Takara公司），通用两步法RTPCR试剂盒（北京博大泰克生物基因技术有限责任公司）。 1.3 实验方法 1.3.1 RTPCR （1）细胞总RNA的提取：用微量天平称取100 mg组织，液氮冷冻，在研钵中不断加入液氮的情况下研磨成粉末状，转入2 ml玻璃匀浆管在冰浴下制成组织匀浆，加入2 ml TRNzol试剂。按试剂说明书提取细胞内的总RNA，紫外分光光度仪（UV755B型，上海精密科学仪器有限公司）测定其浓度和纯度，重复3次，计算样本总RNA浓度，A260/A280值在1.8 2.0之间。（2）RNA完整性的鉴

6、定：溴化乙锭凝胶电泳，显示28 S、18 S及5 S 3条带，且28 S/18 S为2/1。（3）引物的设计与合成：在GenBank查到人类ER和actin（内参）的编码序列及合成引物序列。ER扩增产物的长度为888 bp，上游引物为5AAGAGCTGC CAGGCCTGC3，下游引物为5CATCTCCAGCAGCA GGTCA3；actin扩增产物长度为621 bp，上游引物为5ACACTGTGCCCATCTACGAGG3，下游引物为5AGGGGCCGGACTCGTCATACT3。（4）RTPCR及凝胶成像分析：按照两步法RTPCR试剂盒说明书分别进行反转录和PCR扩增，PCR的反应条件为变

7、性94 1 min,退火55 1 min,延伸70 1 min,共35个循环,最后1个循环72 延伸7 min。取5 l的PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳分离，应用image MASTER凝胶成像仪照相，而后用Labimage灰度分析软件分析ER和actin条带的强度，强度以灰度乘以面积表示。计算ER/actin的值（D值），正常软骨终板的D值/DS软骨终板的D值2.0（ND/DD2.0）即为阳性。 1.3.2 Western blot （1）用微量天平称取50 100 mg组织，加入1 ml裂解液低温快速匀浆，采用紫外分光光度法测定蛋白浓度。取蛋白100 g经10%的SDSPAGE凝胶

8、电泳后转移至硝酸纤维素膜上，5%的脱脂奶粉PBST溶液室温下封闭1 h，PBST洗膜后加入5%的脱脂奶粉PBST溶液配制的兔抗人ER抗体（1500）4 过夜，洗膜后与用HRP标记的二抗进行杂交，洗膜后加入DAB进行显色。（2）结果于image MASTER凝胶成像仪下扫描，扫描结果用Labimage灰度分析软件进行强度分析，强度以灰度与面积的乘积表示。 1.3.3 免疫组织化学法 （1）终板组织经硝酸脱钙、蜡块包埋，蜡块切片（4 m）常规脱蜡水化，柠檬酸组织抗原修复液对切片进行高压抗原修复，加50 l兔抗人ER抗体（1100），室温下孵育1 h，加50 l二抗，室温下孵育10 15 min，加

9、100 l新鲜配制的DAB显色4 min，自来水冲洗终止显色，苏木素复染，切片用酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，对切片拍照。（2）染色阳性表达为棕黄色,无着色为阴性。以不加一抗为对照。 1.3.4 雌激素浓度的测定 采取静脉血2 ml，EDTA抗凝，离心取血清，采用酶联免疫吸附的方法测定。 1.4 统计学处理 实验数据以x-±s表示，采用SPSS 10.0统计软件进行分析，组间比较采用t检验和方差分析，P<0.05为有统计学意义。 2 结 果 2.1 所取标本的人群特征 实验组DS患者的平均年龄为55.5岁（43 68岁），对照组的平均年龄为22.5岁（18 2

10、7岁）；实验组和对照组人群的体重为（61.1±0.822） kg和（59.7±1.095） kg，P=0.052，两组之间无显著差异；实验组和对照组人群的BMI（体重指数）为（23.4±0.482） kg·m-2 和（22.9±0.260） kg·m-2，P=0.09，两组之间无显著差异。 2.2 ER mRNA在腰椎软骨终板中的表达 通过RTPCR检测发现ER mRNA的表达量在DS软骨终板中明显低于正常腰椎（图1A），经灰度分析发现条带强度在DS软骨终板中为0.413±0.032，在正常腰椎软骨终板中为0.842

11、7;0.018，且ND/DD的均值为2.04（图1B），两组之间的差异有显著性（P<0.05）。 2.3 ER蛋白质在腰椎软骨终板中的表达 通过Western blot检测发现ER蛋白质的表达量在DS软骨终板中显著低于正常腰椎，经灰度分析发现条带强度在DS软骨终板中为0.402±0.006，在正常腰椎软骨终板中为0.475±0.020，两组之间的差异有显著性（P<0.05），并且此结果与RTPCR结果基本一致。见图2。 2.4 免疫组织化学染色结果 免疫组织化学检测可见ER为胞内受体；正常女性腰椎软骨终板中胶原纤维排列紧密，DS软骨终板中胶原纤维

12、排列紊乱，细胞数减少；女性DS软骨终板中ER和正常腰椎软骨终板相比明显减少。见图 3。 2.5 血液中雌激素浓度检测结果 人群绝经前女性血液中雌激素的浓度6卵泡期为37 330 pmol·L-1，排卵期为367 1 835 pmol·L-1，黄体期为184 881 pmol·L-1；实验组女性患者血液平均雌激素浓度为56 pmol·L-1，同绝经前相比明显降低。 3 讨 论 腰椎的稳定是其运动节段的内源性稳定因素与外力负荷相互作用时的平衡状态,即一种“稳态”，而不稳则是这种“稳态”被破坏后出现的失稳状态，当这种失稳状态引发出各种临床症状时即出现了不稳症。

13、腰椎的运动节段包括1个椎体间关节和2个关节突关节，正常情况下这3个关节维持着机械性平衡,但如果其中1个出现异常,则最终将破坏这种平衡而使运动节段失去稳定性。过去认为关节突关节的退变、损伤、角度的增加是引起腰椎失稳的主要原因，但Love等4指出小关节角度的增加是小关节炎重建的结果，而不是DS的起始病；并且早在1989年国内学者就已指出，腰椎间盘的退变可引起椎间盘高度下降,关节突关节囊松弛而重叠加大,黄韧带回缩变厚,从而导致腰椎内在力学因素的改变,出现腰椎负重力线的重新分布,使相邻节段的椎体不稳7。 Imada等8通过病例对照研究发现卵巢切除后病人DS的发病率是非切除病人的3倍，他们认为这是由于卵

14、巢切除造成体内雌激素水平急剧下降而使椎旁韧带系统的弹性丧失造成的，而忽略了椎间盘在这其中的作用。Yves等9通过研究雌激素替代和非替代治疗的绝经后妇女椎间盘高度发现，替代治疗组能够显著维持椎间盘的高度。这些研究表明雌激素有维持椎间盘高度、防止椎间盘退变的作用。椎间盘是由软骨终板、纤维环和髓核构成，由于椎间盘是全身最大的无血管组织，其营养来源主要依赖于软骨终板的渗透作用，因此椎间盘功能的维持依赖于软骨终板的功能。软骨终板是由软骨细胞及其分泌的基质型胶原、蛋白多糖和水组成。 Richmond等5通过RTPCR和免疫组化的方法证明了成人软骨细胞中ER、ER的mRNA表达和ER蛋白的存在，表明软骨是雌

15、激素敏感组织。在本研究中通过RTPCR和Western blot发现在软骨终板中存在ER，表明腰椎软骨终板也是雌激素敏感性组织，并且还发现，绝经后DS患者软骨终板中ER较正常腰椎显著下降。近年来的研究表明，雌激素通过一系列的机制作用于软骨细胞，影响软骨组织的基质成分，从而影响其功能。万荣等1011通过在培养的软骨细胞中加入不同浓度的17雌二醇发现，雌二醇影响软骨细胞胶原表型和蛋白多糖的分泌，不同浓度对软骨细胞分泌功能的影响不同,生理浓度的雌二醇可以促进软骨细胞分泌蛋白多糖和型胶原的分泌。另有学者通过卵巢切除术建立雌激素缺乏（绝经）动物模型和17雌二醇替代治疗的研究发现，卵巢切除术后关节软骨的损

16、伤较对照组明显加重，关节软骨和软骨下骨的厚度和硬度增加，雌激素替代治疗可以缓解软骨的损伤1213。雌二醇可以缓和母羊卵巢切除术后关节软骨中蛋白多糖含量和骨密度的下降14。不仅如此，Lee 等15发现通过在培养的软骨细胞中加入17雌二醇，可以降低软骨细胞MMP1的合成，维持MMPs和TIMPs之间的平衡，发挥对软骨细胞的保护作用。采用同样的方法，Horst等16发现雌激素可以保护软骨细胞免受氧化应激的损害作用。同时雌激素可以通过调节胰岛素样生长因子水平增加蛋白多糖和胶原的合成,减少细胞因子介导的软骨基质的降解5。上述研究表明雌激素可以促进终板软骨细胞合成、分泌蛋白多糖和型胶原，从而维持终板软骨的

17、基质成分，对终板软骨发挥保护性作用。 通过检测血液中雌激素浓度发现，女性在绝经后体内雌激素水平显著下降，由于ER本身处于不断合成和分解之中，受其配体雌激素的调节，雌激素水平的下降引起软骨细胞上ER数量和亲和力下调。而刘斌等17通过对椎体终板软骨细胞的提取和培养发现，软骨终板中的软骨细胞和关节软骨细胞的表型和功能相似。由于体内雌激素水平下降、软骨细胞上ER的下调，软骨终板基质分泌下降、降解增加导致软骨终板的退变，影响葡萄糖、氧等营养物质软骨终板的渗透和椎间盘代谢废物的排除，导致髓核内低氧、低葡萄糖、低pH值、高酸的微环境，髓核细胞功能改变，基质分泌功能下降，导致椎间盘的退变。软骨终板和椎间盘的退

18、变使其不能正常发挥其传递负荷、吸收震荡的功能，腰椎的负重力线发生改变，关节突关节负重增加，关节突关节损伤、退变、角度增加，从而发生腰椎不稳，长期的不稳逐渐进展为DS。所以，女性在绝经后体内雌激素水平的下降及软骨细胞上ER的下调可能是DS发生的原因之一。 体重和BMI是引起退行性腰椎不稳的常见影响因素，而在本研究中所选取的实验组和对照组在体重和BMI之间无显著差异，排除了实验组由于与对照组体重和BMI的不同而引起的DS。本研究发现，在腰椎软骨终板中存在ER，并且绝经后退行性腰椎不稳患者体内雌激素浓度较绝经前人群明显下降，软骨终板中ER mRNA和蛋白的表达量较青年女性腰椎软骨终板内显著下调，表明

19、雌激素及其受体可能是退行性腰椎不稳的发生发展原因之一。这为我们进一步研究雌激素及其受体在退行性腰椎不稳中的作用提供了一定的理论基础。【参考文献】 1HA K Y,CHANG C H,KIM K W,et al.Expression of estrogen receptor of the facet joints in degenerative spondylistheisJ.Spine,2005,30(5):562566.2BODEN S D,RIEW K D,YAMAGUCHI K,et al.Orientation of the lumbar facet joints:associatio

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