核酸的提取及纯化

1、如有你有帮助,请购置下载,谢谢!核酸的提取与纯化一DNA的提取与纯化(一)实验目的与主要原理DNA存在于细胞核中.通过裂解组织与细胞,使细胞膜破碎,暴露出DNAW蛋白质的混合物.此时,通过蛋白酶的消化,使DNA与蛋白质进行别离,而后利用硅胶柱或者酚： 氯仿法,去除蛋白质,从而提取高纯度DNA(二)实验材料蛋白质K(20mg/ml),裂解液(100mmol/lTris(pH8.0),500mmol/LEDTA(pH8.0),20mmol/lNaCl,10%SDS),硅胶柱,TE(10mmol/lTris-HCl,1mmol/LEDTA(pH8.0),0.5*TAE(20mmol/lTris-乙酸

2、,0.5mmol/lEDTA,pH8.0),10*Loadingbuffer(50mmol/lEDTA,60%甘油,0.25%M酚蓝,pH7.0).(三)实验方法DNAI取的方法目前主要有两种,一种是利用酚： 氯仿抽提的方法,另一种是利用硅胶柱吸附的方法.其中酚：氯仿抽提法由于试剂具有较强的腐蚀性和毒性,且对环境污染较大,目前使用者较少.而硅胶柱的方法操作比拟简单,且毒性很低,对环境的影响较少,故而被广阔实验者所使用.目前硅胶柱的生产厂家较多,以沉淀方法较为多见,主要步骤如下.1样本前处理哺乳动物细胞：提前准备55c冰浴.如有你有帮助,请购置下载,谢谢!(1)对于贴壁细胞,用胰蛋白酶或其他方法

3、收集细胞,对于悬浮细胞,直接收集细胞.用PBSa3次.(2)参加3倍体积的裂解液,参加蛋白液K终浓度到达500ug/ml,37c孵育46小时.动物组织：提前准备55C,70c水浴.(1)将25mggft物组织切碎,置于一无菌的1.5ml离心管中(注意,尽量越碎越好).(2)参加150200ul的裂解液(含500ug/ml的蛋白酶K),55c孵育直至完全裂解,(因组织不同而异,鼠尾68h,可以过夜裂解,每小时颠倒23次).(3)如果需要去除RNA可以参加适量RnaseA于样品中,室温孵育2min.(4) 12000r离心5min,转移上清于一无菌的离心管.2DNA提取过程(1)利用2倍体积无水乙

4、醇和1/10体积的3mmol/L醋酸钠沉淀DNA(注意沉淀为DNA不能弃去)(2)将上述混合物参加硅胶柱中,12000r离心1min,后用75%的乙醇清洗杂质,洗23次.(3)将硅胶吸附柱置于干净的离心管中,在柱的中央参加200ul预热TE(60C),或去离子水(pH)7.0),室温静置1min,12000r离心1min,洗脱DNA.洗脱出的DNA置于20C保存.如有你有帮助,请购置下载,谢谢!3琼脂糖凝胶电泳11两脂糖的配制：例如：0.15g琼月旨糖+15ml0.5*TAE微波炉加热至沸腾,待降低至70c参加Goldview染料5ug/100ml,倒入小型胶梢中其他规模胶梢按此比例配制.室温

5、静置40min.2取50100ngDNA用去离子水补充体积至10ul,参加1ul10*DNAloadingBuffer,进行电泳.电泳120V2030min电泳液5*TAE四考前须知1裂解液与样品的比例要适当,过少的裂解液可能导致样本裂解不完全,而过多的裂解液也会影响提取效果.2尽量切碎组织,以免影响裂解效果； 完全裂解后可以呈粘稠状.3组织标本一般要保存在-80C冰箱或液氮中,且防止反复冻融；使用无菌离心管和枪头,防止DNA酶污染.RNA勺提取与纯化一实验目的与实验原理RNA勺提取方法有很多种,其中Trizol试剂提取RN蝠目前常用的方法之一.Trizol是由苯酚和异硫富酸月瓜配制而成,在匀

6、浆和裂解过程中,Trizol可以裂解细胞、降解细胞其他成分,但同时保护RNA抑制RNAW活性.在氯仿抽提后,RN隋留在水相中,用异丙醇可以将其沉淀,最后得到RNA如有你有帮助,请购置下载,谢谢！(二)实验材料Trizol,氯仿,DEPCCk,DEPCCk配制75%JI,10*MOPS缓冲液(0.2mol/LMOPS,80mmol/lNaAc,10mmol/lEDTANa),1*MOPS电泳缓冲液(10*MOPS150ml,37%甲醛80ml,加水至1500ml),10*RNA上样缓冲液(50%T油,1mmol/lEDTA,0.25喊酚蓝,0.25%X甲苯青).(三)实验步骤1RNA的提取(1)

7、25cm*25cmW养瓶细胞+1mlTrizol(吹打使之充分裂解)；100ml组织+1mlTrizol(超声破碎仪破碎细胞使之充分裂解),注：6孔板：力口0.5mlTrizol.(2)收集后转入0.5mlEP管,加200ml氯仿.(3)颠倒混匀至氯仿完全混匀,室温23min(发现液面分为两层,上层为清亮,下层为红色).(4)离心：4C,12000r,10min.(5)转上层水相到1.5EP管,尽量防止吸取中层蛋白质层.注：上层为RNA中层为蛋白；下层为DNA(6)等体积异丙醇(400500ul),充分混匀,冰浴10min.注： 如果组织很少,为了增加RNAI取的量,可以将异丙醇-20C预冷.

8、(7)离心：4C,12000r,15min.(8)弃上清,管底可见白色沉淀,即为RNA如有你有帮助,请购置下载,谢谢!(9)力口1ml75%&醇(DEPC水配制),离心：4C,12000r,5min.(10)弃上加1ml75%醇(可根据实验要求省略).(11)离心：4C,12000r,5min,弃上清.(12)短暂离心1min,吸出残留乙醇,室温晾干5min(2025C).(13)参加3040ulDEPCk,立即用于逆转录或置于75%乙醇中保存于-80C冰箱.2RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳(1)配置1.2%甲醛变性琼脂糖凝胶(20ml)琼脂糖0.24g无Rnase水17.4ml10*MOPS2.0ml37狮醛0.6ml将琼脂糖加热融化后,参加10*MOPS待胶冷却至60c左右,参加甲醛倒入胶板.65C5min,冰上骤冷,参加0.51.0ul的澳化乙锭(1.0mg/ml),将配好的1.2%甲醛变性胶先在1*甲醛变性胶电泳缓冲液中预电泳15min.RNA羊品在510V/cm的电压电