试验四微生物平板菌落计数法

1、实验四微生物平板菌落计数法、实验目的 学习并掌握平板菌落计数的基本原理和方法。、实验原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的 2? 3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结 果往往偏低，为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（cfu ）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含

2、量。平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生 物制品检验（如活菌制剂），以及食 品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程 度的检测。三、实验器材1 .菌种：酵母菌。2 ,培养基：YEB培养基。3 .仪器或其他用具：1ml无菌吸管，无菌平皿，盛有 4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。四、实验步骤取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10 -4、 10-5、 10 -6 （稀释度）各2套，另取6支盛有4.5ml无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-

3、5、用1ml无菌吸管吸取1ml已充分混匀的大肠杆菌菌悬液（待测样品），精确地放 0.5ml至10 -1的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。将10 -1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支 1ml吸管插入10 -1试 管中来回吹吸 菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取10 -1菌液1ml ,精确地放0.5ml至10 -2试管中，此即为100倍稀 释。 其余依次类推。放菌液时吸管不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差

4、较大。-4 -5 -63 .倒平板法：1）取样。用三支1ml无菌吸管分别吸取10-4、10-5和10 -6的稀释菌悬液各1ml ,对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放 0.2ml。不要用1ml吸管每 次只靠吸管尖部吸 0.2ml稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。2）倒平板。尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45 C左右的LB培养基约15毫升/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并已冷却至则细菌45 C左右的培 养基，立

5、即摇匀，否将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。于37 C恒温3）待培养基凝固后，将平板倒置培养基中培养。4 .涂布法：涂抹平板计数法与倒平板法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取 0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号 的琼脂平板上（每个编号设三个重 复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀（图22-3）,每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度 涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20- 30min ,使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。5 .计数培养4

6、8h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：每毫升中菌落形成单位（cfu ）=同一稀释度三次重复的平均菌落数 X稀释倍数X5一般选择每个平板上长有 30? 300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适，同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复三个对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由10-4、 10和10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，一般三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后，所出现的平均菌落数在 50个左右为好，否则要适当增加或减少 稀释度加以调整。五、实验结果将培养后菌落计数结果填入下表:稀释度10-410-510-6123平均123平均123平均Cfu数/平板每毫升中的cfu数六、思考题(1 )为什么融化后的培养基要冷却至45 C左右才能倒平板？(2 )要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？(3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接