常温组织RNA提取

1、常温组织RNA提取注意事项背景知识 高浓度蛋白质变性剂(如GIT、GuHCl等)的裂解方法，是抽提RNA的首选。总RNA的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组DNA相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质“缠”住的问题，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的RNA酶，确保了RNA的完整性。除了极少量不适用该方法的样品主要是植物，其它绝大部分样品的RNA的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。RNA抽提的问题，简单可归纳为三个：降解、纯度、得率。判断这三个指标的基本手段是：电泳和紫外分光光度仪。降解只能通过

2、电泳判断；纯度和得率主要使用紫外分光光度仪检测，但电泳也可以提供简单参考。要正确解读电泳或者紫外分光光度仪的结果，首先就要对这两个方法有基础的了解。如果抽提基因组DNA的最大问题是纯度，那么，抽提总RNA的最大问题是降解。降解主要来自两个方面：样品的内源酶的作用和最后溶解用水及离心管的不干净。对大部分实验人员来说，RNA抽提比基因组DNA抽提要困难得多。事实上，现有的 RNA抽提方法/试剂，如果用于从培养细胞中抽提RNA，比抽提基因组DNA更方便，成功率也更高。那为什么同样的方法用于组织RNA的抽提，总会碰到问题呢？ 组织RNA抽提失败的两大现象是：RNA降解和组织内杂质的残留。关于降解问题，

3、首先看一下为什么从培养细胞中抽提RNA不容易降解。现有的RNA抽提试剂，都含有快速抑制Rnase的成分。在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的Rnase，所以RNA得以保持完整。也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触并被及时裂解，所以其RNA不容易被降解；反过来讲，组织中的RNA之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。因此，假定有一种办法，在抑制RNA活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。但是，液氮碾磨方

4、法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制 Rnase活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的Rnase降解RNA的速度快。电动匀浆器效果较好，玻璃匀浆器效果较差，但总的来说，匀浆器方法是不能杜绝降解现象的。因此，如果抽提出现降解，原来用电动匀浆器的，改用液氮碾磨；原来用玻璃匀浆器的，改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨，问题几乎100%能获得解决。影响后续实验的杂质残留问题，其原因比降解更多样，解决方法相应也不同。总之，如果出现降解现象或者组织内杂质残留现象，则必须对具体实验材料的抽提方法/试剂进

5、行优化。优化大可不必使用您的宝贵样品：可以从市场上购买一些鱼/鸡之类的小动物，取相应部分的材料用于RNA抽提，其它部分用于抽提蛋白质用嘴碾磨，肠胃抽提。 基因组DNA残留，是一个容易被厂家糊弄的概念。如果你判断基因组 DNA是否残留的标准是电泳，那么，许多产品都可以做到“无基因组 DNA残留”。这时，你需要问一下：基因组 DNA残留影响的后续实验主要是什么？是 PCR。理论上，PCR的灵敏度是一个分子，也就是 pg级的 DNA残留；电泳可以看见 DNA条带的极限，则不小于 ng级。电泳看不见 DNA残留的意义是，DNA残留少。实践证明，无论是 TRIzol方法、柱离心式方法、甚至包括柱内 DN

6、ase I消化 DNA的方法，都无法确保彻底去除 DNA；真正能彻底去除 DNA残留的方法，只有液体体系下 DNase I的消化。实验前的准备究竟怎样才能确保RNA抽提的成功率呢？实验前的准备是非常重要的。首先，要了解你的实验室环境，了解你的实验环境中可能存在的隐患：是否有同事在进行DNA抽提？是否实验室人员众多？第二，要了解你可以使用的设备：离心机是否可以低温操作？破碎、匀浆的条件怎样？第三，要了解抽提RNA的目的。第四，要了解样品的采集、制备、保存的条件，了解样品的特点。在对上面四点有了充分的了解后，才能正确选择合适的方法/试剂，提高抽提的成功率。选择合适的方法/试剂，这是非常重要的一步；

7、好的方法/试剂在确保成功的同时，操作方便，经济实用。0：抽提RNA的目的RNA用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。cDNA文库构建要求RNA完整而无酶反应抑制物残留；Northern对RNA完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR对RNA完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。投入决定产出；每次都以获得最高纯度的RNA为目的，劳民伤财。1：样品的收集/保存影响降解的因素样品离开活体/或者原来的生长环境后，样品中的内源酶即会开始降解RNA，降解速度与内源酶含量及温度有关。传统上，只有两个办法可以彻底抑制内源酶活性：立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆；切成小块后立即投入

8、液氮冷冻。这两个办法都要求操作快速。后者适合所有的样品，而前者只适合细胞及内源酶含量较低的并且较容易匀浆的组织。液氮碾磨是杜绝内源酶作用的好方法；但如果在碾磨过程中；因为没有及时补充液氮导致样品融化，则总RNA被降解得更快。具体地讲，植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等最好都先用液氮冷冻起来，再往下做。 样品匀浆后的保存，在-20C可以保存一个月左右，但最好使用更低温度保存。新鲜样品的保存，则首先使用液氮速冻，再转移到-70C以下温度保存。新鲜样品直接保存还要注意一点，就是先将样品分割成小块后再保存，而不是大块保存，用前再分割。采集的组织也可以放入RNAguard中保存，-2

9、0C一年不会降解。2：样品的破碎及匀浆影响降解和得率的因素样品的粉碎是为了彻底匀浆，匀浆是为了使细胞破裂，使总RNA彻底完整地释放出来。一般讲来，细胞无须粉碎即可直接匀浆，组织需要破碎后才能匀浆，酵母菌和细菌需要先用相应的酶破壁后才能匀浆。内源酶含量较低并且较容易匀浆的组织可以在裂解液中通过匀浆器一次完成破碎和匀浆过程；植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等样品，它们不是内源酶含量高，就是不容易匀浆，所以必须将组织的粉碎和匀浆分开操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的匀浆方法是使用电动匀浆器。使用液氮碾磨要特别注意一点：在整个碾磨过程中，样品不得融化，因为

10、冷冻过的样品内必定形成冰晶，破坏了细胞内部的结构，使其内源酶更容易起作用。带针头的一次性注射器是一个非常有用的工具。与玻璃允浆器相比，它有三大优点：非常方便；允浆更彻底；可以更好地打断基因组DNA，从而降低裂解液黏度。强烈建议在抽提总RNA前准备一些一次性注射器，以便在实验过程中，一旦发现裂解液体系较为粘稠，可以及时解决。3：裂解液的选择影响操作方便程度，内源杂质残留的因素常用的裂解液几乎都能抑制Rnase活性，因此，选择裂解液的重点是要结合纯化方法一起考虑。只有两个例外：高内源酶含量的样品建议使用含苯酚的裂解液，以增加灭活内源酶的能力；部分样品(主要是植物)不能使用含苯酚的裂解液/或者只能使

11、用某些特别的裂解液。4：纯化方法的选择影响内源杂质残留，抽提速度的因素对于干净的样品，如细胞，手边的几乎任何纯化方法都可以获得满意的结果。但对于许多其它样品，尤其是植物，肝脏，细菌等杂质含量很高的样品，选择合适的纯化方法是至关重要的。柱离心式纯化方法抽提速度快，能有效去除影响RNA后续酶反应的杂质，且重复性高，但价格较贵；使用经济而经典的纯化方法，如LiCl沉淀等，也可以获得满意的结果，但操作时间长，重复性较低。抽提操作中的注意事项抽提操作中的主要事项，首先要参考试剂供应商的建议。无论使用的是柱离心式抽提方法，还是经典抽提方法，下面几点注意事项都是通用的。  1：操作快速。

12、主要指从样品脱离其正常生长条件到彻底匀浆之间的时间要尽可能短。样品被彻底匀浆后，RNA是相对稳定的；此时保持正常的操作速度就可以了。  2：样品要一个一个裂解。在同时抽提多个样品时，操作应该是：取出一个样品，加入裂解液，彻底匀浆，置于冰上；再取出第二个样品同样处理，直到样品全部处理完毕。再同步继续后面的操作。绝对不能在所有样品中加入裂解液后再一个一个匀浆。  3：样品不要过量。RNA抽提如果出现了问题，除了没有获得RNA外，全部都可以由样品过量引起。换一个讲法，如果你的起始样品量比较大，而抽提又出现了问题，你就不容易直观找到原因。样品冻融的影响实验表明，

13、冷冻组织在融化过程中比新鲜组织更容易发生RNA的降解。可能的原因是：冻融过程破坏了细胞内的结构，使内源酶更容易与RNA直接接触。下面是发生冻融的几种常见情况：1：冷冻保存的样品，抽提前的切割。2：冷冻保存样品，抽提前称重。3：液氮碾磨过程中没有及时补充液氮。4：冷冻样品不经过液氮碾磨直接加入裂解液匀浆。如果操作中存在样品冻融的可能，而所获得的RNA也出现了比较强烈的降解，就一定要去除/降低冻融的影响。RNAguard保存的样品没有冻融问题。RNAguard：抑制组织/细胞内源酶的试剂确保RNA不降解的传统做法是：在取组织前将含液氮的容器放在手边，一旦取出所需组织，立即切割小后投入液氮中。抽提前

14、先在碾钵中加入适量的液氮，再将组织从液氮中取出迅速放入已加入液氮的碾钵中碾磨。碾磨过程中要及时补充液氮以防止组织融化。待组织彻底碾磨碎后，等待剩余液氮恰好挥发完时，立即将碾磨碎的组织移入裂解液中快速匀浆.安全的称重几乎不可能。这么严格的操作，是没有多少实验人员去认真执行的。RNAguard能快速抑制样品中的内源酶活性，确保动物组织/细胞中的RNA在37C一天不降解，25C一周不降解，4C一个月不降解，-20C一年以上不降解。RNAguard适用的样品包括：动物组织，培养细胞，昆虫，及部分植物组织。经过RNAguard处理的样品可以用几乎所有常用的RNA方法/试剂抽提RNA，所有的操作与用新鲜组

15、织没有什么不同。使用RNAguard的操作非常简单：在取组织前预先估计组织的重量，在一个容器中加入5-10倍体积的RNAguard，放在手边。取出所需组织后，立即切割成厚度小于0.5厘米，放入含 RNAguard的容器中即可。抽提前先用镊子将组织从RNAguard中取出，在室温进行切割和称重后，移入裂解液中快速匀浆。如果您面临下面的情况之一，您一定会发现使用RNAguard的好处： 1：实验室没有液氮罐或者70C冰箱保存样品。2：易降解样品的RNA抽提或者抽提RNA经常碰到降解问题。3：样品必须准确称重。4：大规模RNA的抽提。5：样品的采集手术室，野外等。67：样品的邮寄。 RNA抽提的“三

16、大纪律八项注意”纪律一：杜绝外源酶的污染。   注意一：严格戴好口罩，手套。   注意二：认真处理实验所涉及到的试剂、耗材、环境。：阻止内源酶的活性   注意三：选择合适的匀浆方法。   注意四：选择合适的裂解液。   注意五：控制好样品的起始量。   注意六：匀浆操作快速而彻底。纪律三：明确自己的抽提目的   注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。   注意八：RNA抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次

17、成功，而不是得率。 Rnase污染的10大来源  1：手指头手指头是外源酶的第一来源，所以必需戴手套并且频繁更换。另外，口罩也必需戴，因为呼吸也是一个重要的酶来源。戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。  2：枪头，离心管，移液器单纯的灭菌是不能灭活Rnase的，所以枪头和离心管要用DEPC处理，即使是标明为DEPC处理过的。移液器最好是专用的，用前用75%的酒精棉球搽拭干净，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪头器。  3：水/缓冲液一定要确保无Rnase污染。  4：实验台面最起码要用75%的酒精棉球搽拭

18、干净。  5：内源Rnase 所有组织均含内源酶，故组织用液氮速冻是降低降解的最好办法。液氮保存/碾磨方法的确不方便，但对有一些内源酶含量很高的组织，却是唯一的办法。  6：RNA样品 RNA抽提产物可能都会含痕量的Rnase污染。  7：质粒抽提质粒抽提往往用到Rnase降解RNA，残留的Rnase要用Proteinase K消化，PCI抽提。  8：RNA保存即使低温保存，痕量的Rnase亦会导致RNA降解。长期保存RNA的最好办法是盐/醇悬液，因为醇在低温时抑制所有的酶活性。  9：阳离子

19、(Ca, Mg) 在含这些离子时，80C加热5分钟会导致RNA被剪切，故如果RNA需要被加热，保存液需要含螯合剂(1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。  10：后续实验所用的酶酶均有可能被Rnase污染。RNA抽提的10大窍门 1：快速阻止Rnase活性样品收集后快速冷冻，裂解时快速操作灭活Rnase。  2：选择合适的抽提方法高核酶含量的组织，脂肪组织最好用含苯酚的方法。  3：预判质量要求 Northern，cDNA文库构建对完整性要求高，RT-PCR, RPA (Ribonuclease prote

20、ction assay)对完整性要求不是很高。RT-PCR对纯度(酶抑制物残留)要求很高。  4：彻底匀浆是提高得率和降低降解的关键。  5：检查 RNA的完整性电泳检测，28S:18S =2:1是完整的标志，1:1对大部分实验也是可以接受的。  6：去除DNA 用于RT-PCR, array analysis最好用Dnase I去除DNA。  7：降低外源酶的污染不能从外面又导入酶。  8：低浓度的核酸浓缩时，要加入助沉淀试剂。但要防止助沉淀剂含酶及DNA污染。  9：彻底

21、溶解RNA，必要时可以65C加热5分钟。  10：合适的保存方法短时间可以20C保存，长期请保存于80C。提高RNA得率的方法首先要知道，不同的样品其RNA含量差别很大。高丰度(2-4ug/mg)的如肝脏、胰腺、心脏，中丰度(0.05-2ug/mg)的如脑、胚胎、肾脏、肺、胸腺、卵巢，低丰度(<0.05ug/mg)的如膀胱、骨、脂肪。如果得率低与抽提有关，下面是可能提高得率的建议：   1：使用更有效的破碎/匀浆方法。RNA如果不能被有效释放出来，得率是会降低的。液氮捣碎、酶消化破壁(Lysozyme/Lyticase)、电动匀浆器匀浆，虽然麻烦，

22、但都是获得高得率的有效手段。  2：抽提试剂的更换。假如得率低不是由匀浆方法不彻底引起，则可能是所使用的试剂的裂解能力差导致。最合理的做法是：使用更多的裂解液；用完后换厂家。另外，可以改用不使用苯酚/氯仿抽提的试剂/方法；使用苯酚/氯仿抽提的方法，由于不可能全部取出上清，RNA的损失是比较大的。  3：延长沉淀时间。如果核酸浓度低，采取低温沉淀、并延长沉淀时间，可以获得非常好的效果。较难抽提样品总RNA抽提方法/试剂的选择贴壁培养细胞：从贴壁培养细胞中抽提总RNA，首先是要彻底去除培养液，然后再裂解细胞。裂解细胞可以直接在培养容器内进行；也可以先将细胞脱

23、壁，移入离心管，再在离心管中进行。如果裂解直接在培养容器内进行，因为培养液是不可能彻底去除的，其残留液体将降低裂解液中所有盐的浓度：司裂解的盐的浓度降低导致裂解效率降低，司沉淀的盐的浓度降低导致沉淀效率降低，综合效果就是降解或者得率低。由于液体的残留量是取决于容器面积的，所以，如果采用直接在培养容器内裂解细胞的方法，裂解液的用量要依据培养容器的面积而调整，而不是根据细胞数使用-这就是贴壁培养细胞抽提总RNA的关键所在。脱壁后裂解的方法，可能碰到的最大问题是，在脱壁过程中部分细胞破碎，这会降低得率。综上所述，小面积的贴壁细胞，因为细胞数少，得率很重要：不要使用可能导致细胞数损失的脱壁后裂解的方法

24、，要使用直接在容器内裂解的方法，但要注意增大裂解液的用量；大面积的贴壁细胞，因为细胞数多，可以使用可能导致细胞数损失的脱壁后裂解的方法，因为它可以节约很多裂解液。纤维组织：从心脏、骨骼肌等纤维组织中抽提总RNA，关键在彻底破碎组织。一定要在液氮冷冻条件下将组织彻底磨碎后再匀浆。同时，这些组织的细胞密度低，故单位重量的组织中，总RNA的含量较少，所以，在试剂容许的范围内，用尽可能多的样品，来确保获得足够多的总RNA。蛋白/脂肪含量高的组织：从脂肪组织、脑、及部分脂肪含量高的植物中抽提总RNA，关键是彻底去除脂肪。去除脂肪的最好试剂是氯仿。即使在抽提步骤中使用了苯酚/氯仿，如果发现上清含白色絮状物

25、，或者液相上面还有一相，提示有脂肪残留。此时必须用氯仿再次对上清进行抽提。核酸含量高的组织：脾、胰腺、胸腺等核酶含量很高，同时，它们的核酸含量也非常高，降解是非常容易发生的。从这样的样品中抽提总RNA，最好使用含苯酚的裂解液，同时要增加裂解液用量，或者减少样品用量。样品在液氮冷冻条件下碾磨，再快速匀浆，方能有效灭活核酶。新鲜组织用玻璃匀浆器匀浆，非常容易导致降解。如果发现裂解液太粘稠(因为核酸含量高的缘故)，苯酚/氯仿抽提后的离心分层往往会碰到问题：不是分不开，就是中间层很厚。用注射期抽打裂解物，或者加入更多裂解液，都可以部分解决此问题。最好用酸性苯酚/氯仿对上清进行再次抽提，以去除可能残留的

26、基因组DNA。如果在上清中加入醇后马上有白色沉淀形成，则提示有DNA污染。溶解后用酸性苯酚/氯仿再次抽提，可以去除DNA污染。植物组织：植物组织比动物组织更为复杂。一般，大家都是在液氮条件下对植物进行碾磨的，所以内源酶作用使RNA降解的现象不常见。如果降解问题不能解决，几乎可以肯定是样品中的内含杂质所致植物中的许多杂质，可以导致总RNA在抽提过程中被降解。另外，许多植物的内含杂质都会导致残留；之所以残留，往往是因为这些杂质与总RNA有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附-这些特点决定了它们是非常强的酶抑制剂。还有一点也要注意，就是有些植物不能使用含某些试剂(比如苯酚)的裂解液。目前，商品化的

27、RNA抽提试剂经过小量调整，可以适合几乎所有的动物组织，但却没有一种商品化的总RNA抽提试剂，可以适合大部分植物组织。所以，从植物样品中抽提总RNA，一定要做预实验，必要时对原来的操作进行调整优化。如果发现抽提的总RNA出现比较强烈的降解，排除了其它原因后，单纯由内源酶导致的具体原因及对策如下：直接在培养容器内裂解的贴壁细胞：裂解液用量不足或者没有彻底去除培养液，将导致降解。对策是：首先要彻底去除培养液；其次，培养液的用量要按照培养容器的面积使用。新鲜动物组织：组织破碎不彻底，或者操作时间过长，或者裂解液用量不足。改用更强的破碎组织的方法，操作更快速，能解决前两个问题。裂解液用量不足，也包括相

28、对用量即内源酶含量高的组织，如胰腺，要使用相对比较多的裂解液。在试剂使用量方面，千万不要死板地按照试剂使用说明进行往往，那指的是熟手抽提最简单样品时的用量。最可靠的方法是，按照说明提示的一半使用组织。冷冻保存组织：保存方法不正确，或者切割秤重，或者破碎方法不正确。组织的保存，必须经过液氮速冻后，才能移入冰箱保存。即使曾经有过直接保存而不降解的经历，也不要相信总有那么好的运气。组织最好在保存前就已经分割好了，冷冻保存组织的分割有非常非常大的降解风险。秤重不要去做，或者在保存前就秤好。冷冻保存样品，包括细胞，都要使用液氮碾磨破碎，只有这样才能确保样品在彻底匀浆前不会出现融化。液氮碾磨过程绝对不能出

29、现液氮不足的现象；碾磨好后，一定要在液氮完全挥发之前，将样品移入裂解液中迅速匀浆。植物组织：破碎方法不正确，或者裂解试剂不适用。液氮碾磨过程绝对不能出现液氮不足的现象；碾磨好后，一定要在液氮完全挥发之前，将样品移入裂解液中迅速匀浆。裂解试剂不适用可能更普遍。有一些植物，因为内含某些成分，非常容易导致总RNA的降解。这些植物，如果使用一般的裂解液，都得不到完整的总RNA。必须在裂解液中添加某些成分，如PVP、PVPP等，去除那些导致总RNA降解的成分，方能获得完整的总RNA。RNase的灭活处理(DEPC和Proteinase K)  1：高压灭菌是可以灭活部分Rnase A

30、的。实验证明：37 C与RNA反应，没有灭菌的PBS，活性点为100 pg/ml；灭菌后，活性点为100 ng/ml。当然，灭菌后Rnase仍然不能认为没有残留。  2：0.01% DEPC，0.1% DEPC，1% DEPC有效去除Rnase A的浓度分别为：100 ng/ml，500ng/ml，1 ug/ml。但要注意，DEPC灭活后的副产品，对有些后续实验是有影响的。  3：DEPC在水中半衰期为30分钟。0.1%的DEPC灭菌15分钟可以认为彻底破坏了DEPC。破坏后可以闻到一点气味。  4：DEPC并不是不能处理Tris的。

31、在1M Tris、1M HEPES、1M MOPS中分别加入1ug/ml Rnase A和0.1%及1% DEPC实验。结果提示，0.1% DEPC只对MOPS有效，而1% DEPC对三种试剂都有效。  5：Proteinase K是完全可以替代DEPC灭活RNase的。其依据是：作为蛋白质，RNase非常容易被Proteinase K消化掉；而100C 15分钟就可以彻底灭活Proteinase K的活性。Proteinase K的用量与溶液的RNase残留量有关，一般在溶液中加入Proteinase K至终浓度0.5 1.0 mg/L，室温放置30分钟以上，再高温灭活P

32、roteinase K，就能确保RNase-Free了。 RNA的电泳检测通常，使用电泳判断RNA的完整性。理论上，完整的RNA拥有28S:18S = 2.7:1的比例，大部分资料则强调28S:18S = 2:1的比例。事实是，除了细胞外，从其它样品中抽提的RNA几乎都得不到2:1的比例，原因是大分子rRNA的二级及三级结构程度更高，所以较之小分子rRNA更容易降解；当28S有相当程度的降解时，18S (包括mRNA)却相当完整(此结论使用Agilent Bioanalyzer获得)。另外，来自不同器官的组织，在确定其mRNA没有降解的前提下，其比例也有区别 （如肝/肺的比例较低）。可以说，2

33、:1是高质量的标准，但低于2:1并不就是质量低。准确评估28S:18S比例并不容易，因为RNA的电泳结果受许多因素的影响，包括二级结构，电泳条件，上样量，被EB饱和的程度等。电泳后应能看到两条非常明显的条带(真核：28S+18S， 原核及细菌：23S+ 16S)， 其中28S (或者23S) RNA应为18S (或者16S) RNA量的1 - 2倍，否则表示RNA样品的降解。电泳看到多一些条带不是问题，尤其是非变性电泳条件下。RNA完整性的检测，可以使用简单的非变性电泳。不过要牢记的是：在非变性条件下，RNA的二级结构改变了泳动方式，使之不按真实大小泳动；同时，条带不够紧密，甚至出现多条带。6

34、5C加热5-10分钟后再上样电泳，可以部分破坏RNA的立体结构，获得更漂亮的电泳结果。使用非变性电泳检测RNA，当用1.0 1.2%的进口品牌Agarose电泳，以DNA Marker做对照，28S和18S条带分别在2kb和0.9kb左右。最好使用含溴酚蓝/二甲苯青两种染料的上样液，因为RNA的非变性电泳的带型可以非常简单地总结如下：(由快到慢) 5S RNA、溴酚蓝、18S、28S、二甲苯青、残留的基因组DNA。柱离心式抽提的RNA，电泳图可能会看不到5S RNA，TRIzol方法抽提的可能会看不到基因组DNA，这都不是问题。如果18S/28S分不开，一种可能是上样量过大，另外一种可能是时间

35、不够。如果18S往下出现弥散，提示降解；如果往上出现弥散，提示上样量过大及可能盐残留过多。使用过的胶和电泳缓冲液是不大可能跑出好的电泳图的。RNA的分光光度计检测首先要明确该指标用于核酸的原始含义是：纯的RNA，其A260/280 = 2.0左右。纯RNA是因，A260/A280 = 2是果。现在大家却在拿A260/A280当因用，认为“如果A260/A280 = 2，所以RNA是纯的”，自然会产生困惑。有兴趣的话，可以在您的RNA样品中加入一点抽提中经常使用的试剂，如苯酚，异硫氰酸胍，PEG等，再测A260/A280比值。事实上，许多抽提RNA时使用的试剂，以及样品中的许多杂质都在A260和

36、A280处附近有吸收，对A260/A280产生影响。所以，目前最具有指导性的做法是：对RNA样品在200-300 nm范围扫描。纯RNA的曲线具有如下特点：曲线平滑，A230和A260是两个拐点，A300接近0，A260/A280 = 2左右，A260/A230 = 2左右，A260/A215 = 1左右。如果没有扫描数据，也一定要测定A260/A230比值，因为该比值对所有影响酶反应的杂质的残留更敏感。要考虑设备的线形范围(A260要处于0.1 0.5之间)。另外有两个有用的现象：在水中测定A260/A280，比值将变低0.3左右；而在10mM EDTA中测定的比值比在1mM EDTA中测定

37、的高0.2左右。    RNA小知识    1： 涉及RNA的一切操作必须戴手套并频繁更换。进口原装离心管和原装移液器头可以直接用于RNA抽提，并不需要进行处理。实验涉及的其它物品，包括移液器杆、电泳槽等，均需做必要的处理。移液器的金属退头器是RNA酶的一个重要来源，实验前最好取下它。  2： RNA浓度越高，沉淀越快越完全。RNA浓度低于10 ug/ml， 要添加沉淀载体才能有效沉淀。 3:  RNA的组成：     

38、60;   Poly (A) RNA = 2-3% total RNA                          rRNA = 8085% total RNA             

39、;              tRNA = 15 - 20% total RNA  4:  A260： 是测定RNA浓度(量)的指标。                         

40、60; 1 OD (260 nm)总RNA = 40 ug/ml (测定溶液：水)                           1 OD (260 nm)单链RNA = 35 ug/ml (测定溶液：水) 5： 杂质的影响：对绝大部分实验来说，纯度比完整性更重要，因为绝大部分的后续实验是酶反应。残留的有机物，金属离子，酶

41、等将对后续酶反应产生巨大的影响。下面的实验是非常简单实用的：RNA样品37oC温浴2小时后，与未温浴的RNA同时电泳。如果温浴后RNA降解超过20%，样品则可能不适合后续的酶反应。 RNAex Reagent RNAex是基于无介质、无苯酚/氯仿抽提理念，研发成功的抽提 总RNA的水性裂解试剂；抽提过程不使用苯酚/氯仿抽提。该裂解液具有极强的裂解能力。在使核酸游离在液体体系的同时，快速灭活样品内的RNase，同时使蛋白质发生变性。变性的蛋白质离心后以沉淀方式被去除，而上清中的RNA被异丙醇“选择性”沉淀下来后， 经过简单的洗涤，最后用水将RNA沉淀溶解，获得的即是纯度高、电泳看不到基因组残留的总RNA。 RNAex Reagent 可以从众多样品中抽提总RNA。样品包括组织、细胞、Gram-菌等。部分有特殊前处理要求的样品，其前处理所需的试剂由用户自备。 主要特征不使用苯酚/氯仿。裂解/去蛋白同时进行。裂解液用量可低至100 ul操作简单、快速。  RNAex操作步骤  1： 样品的