实验三、动物性食品生物性污染的检验ppt课件

1、动物性食品卫生学实验动物性食品卫生学实验一一. .生物性污染的来源生物性污染的来源p微生物污染微生物污染 (microorganism pollution )(microorganism pollution )p寄生虫污染寄生虫污染 (parasitical pollution )(parasitical pollution )p昆虫污染昆虫污染 (insectical pollution )(insectical pollution )PathogensSpoilage OrganismsVirusesBacteriumMicroorganismsUnpleasant smell and t

2、asteFungi 内源性污染内源性污染 外源性污染外源性污染外源性生物性污染是动物性食品微生物污染的主要途径外源性生物性污染是动物性食品微生物污染的主要途径二二. .生物性污染的评价目的生物性污染的评价目的 菌落总数菌落总数 细菌总数细菌总数 大肠菌群值大肠菌群值MPNMPN 致病菌检测致病菌检测(PCR(PCR法法) ) 其他其他实验目的实验目的 掌握动物性食品菌落总数、大肠菌群测定掌握动物性食品菌落总数、大肠菌群测定及常见致病菌及常见致病菌PCRPCR检测的原理、步骤和方法检测的原理、步骤和方法 了解动物性食品菌落总数的卫生规范，进了解动物性食品菌落总数的卫生规范，进展卫生断定展卫生断定

3、 1. 1.鲜乳的微生物学检验鲜乳的微生物学检验 菌落总数的测定菌落总数的测定检检 验验 处处 理理24 2h或或48 2h36 1 报报 告告菌落记数菌落记数每皿参与适量营养琼脂每皿参与适量营养琼脂选择选择3个适宜稀释度，汲取个适宜稀释度，汲取1ml参与灭菌平皿参与灭菌平皿作成几个倍数的稀释液作成几个倍数的稀释液注注 意意 事事 项项 无菌操作无菌操作 稀释度的选择稀释度的选择 平均菌落数在平均菌落数在30-30030-300之间的稀释度为之间的稀释度为宜；宜； 每个稀释度作两个平皿每个稀释度作两个平皿 记数要求记数要求 30-30030-300 300300 3030 300300或或 3

4、0302.2.鲜乳大肠菌群值的测定鲜乳大肠菌群值的测定 报报 告告 根据证明为大肠菌群阳性的管数，查根据证明为大肠菌群阳性的管数，查MPNMPN检索表，检索表，报告每报告每100mL(g)100mL(g)检样中大肠菌群的最能够数。检样中大肠菌群的最能够数。断定规范断定规范3. 常见致病菌的快速检测常见致病菌的快速检测 SE的的PCR检测检测 原原 理理 以扩增的以扩增的DNADNA分子为模板，以一对分分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNADNA聚合酶的作用下，按半保管复制的机制聚合酶的作用下，按半保管复制的机制沿着模板链延伸直至完成新

5、的沿着模板链延伸直至完成新的DNADNA合成。不合成。不断反复这一过程，可使目的断反复这一过程，可使目的DNADNA片段得到扩片段得到扩增。由于新合成的增。由于新合成的DNADNA也可以作为模板，因也可以作为模板，因此此PCRPCR可使可使DNADNA的合成量呈指数增长。的合成量呈指数增长。 PCRPCR的根本成分的根本成分 模板模板DNADNA 特异性引物特异性引物(SEF14)(SEF14) 热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶 dNTPdNTP 二价阳离子二价阳离子 缓冲液缓冲液 过过 程程 ( (高温变性、低温退火、中温延伸高温变性、低温退火、中温延伸) ) 引物设计引物设计 利用引物

6、设计软件利用引物设计软件Primer5.0Primer5.0针对针对SEF14SEF14主要构造亚单位主要构造亚单位sefAsefA的基因序列的基因序列设计引物设计引物: : 上游引物上游引物Usef AUsef A为为5-5-ATGCGTAAATCAGCATCTG-3ATGCGTAAATCAGCATCTG-3；下游引物；下游引物LsefALsefA为为5-TTAGTTTTGATACTGCTGAAC-35-TTAGTTTTGATACTGCTGAAC-3样品处置模板制备样品处置模板制备以以12000rpm12000rpm离心离心5min,5min,上清液即含基因组上清液即含基因组DNADNA待检

7、肉样乳待检肉样乳1g/mL1g/mL以以9mL9mL增菌液混合研碎，增菌液混合研碎，制成食品匀浆液制成食品匀浆液3737振荡培育振荡培育3 3小时小时取样液取样液1mL1mL以以2000rpm2000rpm离心离心2min,2min,取上清液取上清液以以8000rpm8000rpm离心离心5min,5min,沉淀以沉淀以50uL50uL悬浮悬浮沸水浴沸水浴10min10min后迅后迅速置冰浴速置冰浴5min5min 反响体系反响体系10Buffer 2.5uLdNTP 2.0MgCl2 2.0上游引物上游引物20uM 1uL下游引物下游引物 20uM 1uL模模 板板 2uLTaq DNA P

8、olymerase 0.25 灭菌灭菌ddH2O up to 25uL 反响参数反响参数 1. Initial denature 95 1. Initial denature 95 5 min 5 min 2. Denature 2. Denature 95 60s95 60s 3. Anealing 3. Anealing 47 60s 47 60s 4. Elongation 4. Elongation 72 60s72 60s Return to 2 for 30 cycleReturn to 2 for 30 cycle 5. Final elongation 72 5. Final elongation 72 10 min 10 min Keep 4 Keep 4 5 min5 min 琼脂