酶工程及其运用

1、1酶工程与食品产业酶工程与食品产业21 1、基因工程的不足、基因工程的不足(1)(1)基因工程的实质：将一种生物的基因工程的实质：将一种生物的 转移到另一转移到另一种生物体内，使后者产生本不能产生的种生物体内，使后者产生本不能产生的 ，进而表现出新的进而表现出新的 。(2)(2)基因工程的不足：在原则上只能生产自然界已存在基因工程的不足：在原则上只能生产自然界已存在的的 。2 2、天然蛋白质的不足、天然蛋白质的不足 天然蛋白质是生物在长期天然蛋白质是生物在长期 过程中形成的，它过程中形成的，它们的们的 符合特定物种符合特定物种 的需要，却不的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。一定完全

2、符合人类生产和生活的需要。基因基因蛋白质蛋白质性状性状进化进化结构和功能结构和功能生存生存蛋白质工程的崛起蛋白质工程的崛起蛋白质蛋白质3蛋白质工程在酶中的应用蛋白质工程在酶中的应用 (1)(1) 改变酶的催化活性改变酶的催化活性(2)(2) 改变酶的底物专一性改变酶的底物专一性(3)(3) 提高酶的稳定性提高酶的稳定性(4)(4) 改变酶的反应特性改变酶的反应特性(5)(5) 产生新酶产生新酶41 1 酶工程概述酶工程概述2 2 酶的生产与分离纯化酶的生产与分离纯化3 3 酶的化学修饰酶的化学修饰4 4 酶的固定化酶的固定化5 5 酶反应器与酶传感器酶反应器与酶传感器6 6 酶在食品工业中的应

3、用酶在食品工业中的应用酶工程与食品产业酶工程与食品产业5酶的定义：酶的定义：酶是指具有生物催化功能的生物大分酶是指具有生物催化功能的生物大分子，按照其化学组成，可以分为子，按照其化学组成，可以分为蛋白类酶蛋白类酶(P(P酶酶) )和和核酸类酶核酸类酶(R(R酶酶) )两大类。蛋白酶主两大类。蛋白酶主要是由蛋白质组成，核酸类酶主要由核酸要是由蛋白质组成，核酸类酶主要由核酸(RNA)(RNA)组成。组成。1 酶工程概述酶工程概述6酶的特性：酶的特性： 酶催化作用的专一性强酶催化作用的专一性强 酶催化作用的效率高酶催化作用的效率高 酶催化作用的条件温和酶催化作用的条件温和1 酶工程概述酶工程概述7酶

4、工程酶工程就是指借助工程学的手段，将酶就是指借助工程学的手段，将酶所具有的生物催化作用，应用于生产、生活、所具有的生物催化作用，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。 概括地说，酶工程是由概括地说，酶工程是由酶制剂的生产和酶制剂的生产和应用应用两方面组成的。酶工程的应用主要集中两方面组成的。酶工程的应用主要集中于于食品工业食品工业、轻工业轻工业以及以及医药工业医药工业中。中。1 酶工程概述酶工程概述8 通常所说的通常所说的酶工程指用工程菌生酶工程指用工程菌生产酶制剂产酶制剂，而没有经过由酶的功能来，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结

5、构，然后由酶的分子设计酶的分子结构，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。骤。1 酶工程概述酶工程概述9因此，因此，酶工程的重点在于对已存酶工程的重点在于对已存在酶的合理充分利用，而蛋白质工程在酶的合理充分利用，而蛋白质工程的重点在于对已存在的蛋白质分子的的重点在于对已存在的蛋白质分子的改造改造。当然，随着蛋白质工程的发展，。当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。程成为蛋白质工程的一部分。1 酶工程概述酶工程概述10酶工程酶工程(Enzyme Engineering)(E

6、nzyme Engineering)：指从应指从应用目的出发研究酶，在一定的生物反应装用目的出发研究酶，在一定的生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化置中利用酶的催化性质，将相应原料转化成有用的物质。它是酶学和工程学相互渗成有用的物质。它是酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学，是酶学、透结合形成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学。而产生的边缘科学。 酶工程的概念酶工程的概念111 1、化学酶工程、化学酶工程自然酶的开发自然酶的开发酶的化学修饰酶的化学修饰酶的固定化酶的固定化人工合成酶的研究人工合

7、成酶的研究酶工程的研究内容酶工程的研究内容122 2、生物酶工程、生物酶工程酶基因的克隆表达酶基因的克隆表达( (克隆酶克隆酶) )酶的遗传修饰酶的遗传修饰( (突变酶突变酶) )酶的遗传设计酶的遗传设计( (新酶新酶) )酶工程的研究内容酶工程的研究内容13酶学研究简史酶学研究简史1878 1878 德国的德国的KuhneKuhne定义定义EnzymeEnzyme原意为在酵母中原意为在酵母中1926 1926 美国的美国的SumnerSumner从刀豆中得到脲酶结晶从刀豆中得到脲酶结晶(1947(1947年诺贝尔奖年诺贝尔奖) )1970 1970 美国的美国的SmithSmith发现限制性

8、内切酶发现限制性内切酶(1979(1979年诺贝年诺贝尔奖尔奖) )1969 1969 日本固定化氨基酰化酶，第一次将固定化酶日本固定化氨基酰化酶，第一次将固定化酶成功地应用于工业生产。成功地应用于工业生产。酶工程诞生酶工程诞生1986 1986 美国发现核酶，获得诺贝尔奖美国发现核酶，获得诺贝尔奖14酶的具体应用表现酶的具体应用表现 u纤维素的水解：纤维素的水解：果汁生产、香料生产、脱水蔬果汁生产、香料生产、脱水蔬菜生产、豆类制品加工、速溶茶生产、酒精、菜生产、豆类制品加工、速溶茶生产、酒精、单细胞蛋白生产、酱油生产、制酒工业、纤维单细胞蛋白生产、酱油生产、制酒工业、纤维废渣转化等。废渣转化

9、等。u淀粉糖类的生产：淀粉糖类的生产：淀粉酶、葡萄糖淀粉酶生产淀粉酶、葡萄糖淀粉酶生产- -葡萄糖、果葡糖浆葡萄糖、果葡糖浆( (淀粉液化淀粉液化糖化糖化异构异构化化) )生产、麦芽糖生产。生产、麦芽糖生产。 15u低聚糖的生产：低聚糖的生产：低聚果糖低聚果糖( (果糖转移酶果糖转移酶) )、大、大豆低聚糖的生产、异麦芽寡糖豆低聚糖的生产、异麦芽寡糖( (- -葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶) ) u干酪生产：干酪生产：凝乳酶酶法凝乳酶酶法 牛乳牛乳( (酪蛋白酪蛋白) )的凝的凝结结( (副酪蛋白钙副酪蛋白钙)沥干乳清沥干乳清干酪成熟干酪成熟u啤酒澄清：啤酒澄清：固定化木瓜蛋白酶固定化木瓜蛋白酶 u食

10、品保鲜：食品保鲜：葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶( (催化葡萄糖生成葡催化葡萄糖生成葡萄糖酸内酯萄糖酸内酯) )酶的具体应用表现酶的具体应用表现 16国内外酶制剂工业概况国内外酶制剂工业概况近年来，随着酶工程研究的发展，酶近年来，随着酶工程研究的发展，酶产业的发展也非常迅速，产业的发展也非常迅速，成为成为21世纪大有世纪大有发展前途的新兴产业之一发展前途的新兴产业之一。据报道，全球。据报道，全球已发现的酶有已发现的酶有3000多种，目前工业上生产多种，目前工业上生产的酶有的酶有60多种，真正达到工业规模的只有多种，真正达到工业规模的只有 20多种，剂型和品种有多种，剂型和品种有600多个。多个。17

11、国内外酶制剂工业概况国内外酶制剂工业概况就世界范围而言，酶制剂总产量最大的是蛋就世界范围而言，酶制剂总产量最大的是蛋白酶类，主要用于洗涤剂、制革和乳品工业白酶类，主要用于洗涤剂、制革和乳品工业其次为淀粉酶类，主要用于食品酿造、淀粉其次为淀粉酶类，主要用于食品酿造、淀粉加工、造纸、纺织等工业加工、造纸、纺织等工业其它酶类则包括药用酶、试剂酶、工具酶等其它酶类则包括药用酶、试剂酶、工具酶等18国内外酶制剂工业概况国内外酶制剂工业概况BCC最新研究报告显示最新研究报告显示：2011年全球年全球工业酶制剂的市场价值为工业酶制剂的市场价值为39亿美元，并以亿美元，并以9.1%的复合年增长率增长，的复合年

12、增长率增长，2016年将增加年将增加到约到约61亿美元。其中，生物酶将以亿美元。其中，生物酶将以8.2%的的复合年增长率增长；食品和饮料活性酶将复合年增长率增长；食品和饮料活性酶将以以10.4%的年均复合增长率增长。的年均复合增长率增长。19国际市场酶制剂销售额比例国际市场酶制剂销售额比例 20国内酶制剂销售额比例国内酶制剂销售额比例21我国的酶制剂工业概况我国的酶制剂工业概况 我国的酶制剂工业是在解放后逐渐发展起来的。我国的酶制剂工业是在解放后逐渐发展起来的。早期是用动植物组织提取胃蛋白酶、胰酶和麦芽早期是用动植物组织提取胃蛋白酶、胰酶和麦芽淀粉酶等，规模小，产量亦少。淀粉酶等，规模小，产量

13、亦少。六十年代中期，六十年代中期，我国开始研制第一个微生物酶制我国开始研制第一个微生物酶制剂剂BF-7658BF-7658淀粉酶。淀粉酶。19651965年轻工部在无锡投资年轻工部在无锡投资兴建了兴建了全国第一家酶制剂厂全国第一家酶制剂厂无锡酶制剂厂无锡酶制剂厂( (现现名是星达生物工程有限公司名是星达生物工程有限公司) )，标志着我国酶制剂标志着我国酶制剂工业的起步工业的起步。 22u我国酶制剂的产品结构我国酶制剂的产品结构u我国酶制剂生产的特点我国酶制剂生产的特点 u我国酶制剂产业存在的问题我国酶制剂产业存在的问题我国的酶制剂工业概况我国的酶制剂工业概况 23u我国酶制剂的产品结构我国酶制

14、剂的产品结构 目前我国酶制剂的主要产品是目前我国酶制剂的主要产品是淀粉酶淀粉酶( (其中大部分是其中大部分是糖化酶糖化酶) )，其次是，其次是蛋白酶蛋白酶，其它酶的产量甚微。其它酶的产量甚微。酶名称酶名称 占酶总产量的百分率占酶总产量的百分率糖化酶糖化酶 71.471.4蛋白酶蛋白酶 14.314.3-淀粉酶淀粉酶 13.413.4其它其它 1 124u 我国酶制剂生产的特点我国酶制剂生产的特点 部分酶制剂品种和质量接近国际先进水平部分酶制剂品种和质量接近国际先进水平生产企业逐步向规模化和现代化发展生产企业逐步向规模化和现代化发展 产品价格具竞争力产品价格具竞争力 行业管理确保企业健康发展行业

15、管理确保企业健康发展 酶制剂的应用促进了食品工业的发展酶制剂的应用促进了食品工业的发展 25u 我国酶制剂产业存在的问题我国酶制剂产业存在的问题技术研究与开发滞后技术研究与开发滞后行业和企业规模小而分散，市场调控能力弱行业和企业规模小而分散，市场调控能力弱应用结构、产品结构不合理，技术含量低应用结构、产品结构不合理，技术含量低应用的深度和广度不够应用的深度和广度不够产品品级产品品级低低26思考：绝大多数酶都是蛋白质，酶工程与思考：绝大多数酶都是蛋白质，酶工程与蛋白质工程有什么区别？蛋白质工程有什么区别？ 通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没有经过

16、由酶的功能来设计酶的分子结构，然后由有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利因此，酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白用，而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着蛋白质工程的发展，质分子的改造。当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。质工程的一部分。 271 1 酶工程概述酶工程概述2 2 酶的生产与分离纯化酶的生

17、产与分离纯化3 3 酶的化学修饰酶的化学修饰4 4 酶的固定化酶的固定化5 5 酶反应器与酶传感器酶反应器与酶传感器6 6 酶在食品工业中的应用酶在食品工业中的应用酶工程与食品产业酶工程与食品产业282 酶的生产与分离纯化酶的生产与分离纯化酶的生产：酶的生产：化学合成与分离提取化学合成与分离提取 国际生化学会已确认国际生化学会已确认21002100种以上的酶。种以上的酶。产酶菌种的要求：产酶菌种的要求： 繁殖快，产酶量高，发酵周期短繁殖快，产酶量高，发酵周期短适应性强、易培养和控制适应性强、易培养和控制产酶性能稳定，不易退化，不易感染噬菌体产酶性能稳定，不易退化，不易感染噬菌体 产生的酶容易分

18、离纯化产生的酶容易分离纯化菌种本身和代谢产物安全无毒，不会致病菌种本身和代谢产物安全无毒，不会致病29酶的发酵生产酶的发酵生产优点：优点：微生物生长繁殖快，生活周期短，产量高；微生物生长繁殖快，生活周期短，产量高；微生物培养方法简单，生产原料大多为农副产品，微生物培养方法简单，生产原料大多为农副产品，来源丰富，价格低廉，机械化程度高，经济效益来源丰富，价格低廉，机械化程度高，经济效益高；高；微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全；微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全；微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的适应、诱导、

19、诱变及基因工程等方法培育出新的产酶菌种。产酶菌种。 30酶的发酵生产酶的发酵生产发酵方法：发酵方法：固体发酵法固体发酵法：以麸皮、米糠等为原料，加无机盐以麸皮、米糠等为原料，加无机盐和适量水份和适量水份(50(50%) )进行微生物培养的方法。进行微生物培养的方法。液体发酵法液体发酵法：利用合成的液体培养基在发酵罐内利用合成的液体培养基在发酵罐内进行搅拌通气培养。进行搅拌通气培养。 (1)(1)间歇发酵：先在适合菌体生长的条件下培养，再转入间歇发酵：先在适合菌体生长的条件下培养，再转入产酶条件下进行发酵。产酶条件下进行发酵。 (2)(2)连续发酵：先将菌体培养至某一生长期连续发酵：先将菌体培养

20、至某一生长期( (对数期对数期) )，再，再连续加入新鲜培养液，又不断地以相同速度放出培养物。连续加入新鲜培养液，又不断地以相同速度放出培养物。31发酵条件：发酵条件：既要有利于菌体的生长繁殖，又不影响酶既要有利于菌体的生长繁殖，又不影响酶的产生的产生培养基组成、通风、温度培养基组成、通风、温度掌握酶的回收期掌握酶的回收期酶的发酵生产酶的发酵生产32提高酶发酵产量的方法提高酶发酵产量的方法 (1)(1)酶的合成调控机制酶的合成调控机制 原核生物酶的合成主要是在转录水平上进行原核生物酶的合成主要是在转录水平上进行调节，调节方式主要有酶合成的调节，调节方式主要有酶合成的诱导诱导和酶合成的和酶合成的

21、阻遏阻遏两种方式。两种方式。原核生物原核生物中酶合成的诱导和阻遏作用机制都中酶合成的诱导和阻遏作用机制都可以用可以用JacobJacob和和MonodMonod提出的提出的操纵子理论操纵子理论来解释。来解释。33提高酶发酵产量的方法提高酶发酵产量的方法 (1)(1)酶的合成调控机制酶的合成调控机制 u操纵子是由调节基因操纵子是由调节基因( (R) )、启动基因、启动基因( (P) )、操纵、操纵基因基因( (O) )和结构基因和结构基因( (S) )组成的，染色体上控制组成的，染色体上控制蛋白质合成的一个完整的基因表达单位。（附着蛋白质合成的一个完整的基因表达单位。（附着RNARNA聚合酶）聚

22、合酶）u操纵基因受调节基因操纵基因受调节基因( (转录合成阻遏蛋白转录合成阻遏蛋白) )操控。操控。u调节蛋白：调节基因产生的一种变构蛋白。两个调节蛋白：调节基因产生的一种变构蛋白。两个结合位点：操纵基因结合位点、效应物结合位点。结合位点：操纵基因结合位点、效应物结合位点。两种类型：阻遏蛋白、阻遏蛋白原。两种类型：阻遏蛋白、阻遏蛋白原。34(1)(1)酶的合成调控机制酶的合成调控机制 u诱导：诱导：有些酶在通常情况下不合成或很少有些酶在通常情况下不合成或很少合成，加入诱导物后，就能大量合成，这合成，加入诱导物后，就能大量合成，这种现象称为诱导。（诱导物与阻遏蛋白结种现象称为诱导。（诱导物与阻遏

23、蛋白结合，淀粉酶、纤维素酶、单宁酸酶）合，淀粉酶、纤维素酶、单宁酸酶） u阻遏：阻遏：分为分为尾产物阻遏尾产物阻遏和和分解代谢产物阻分解代谢产物阻遏遏两种。两种。35(1)(1)酶的合成调控机制诱导酶的合成调控机制诱导 酶酶合成方式合成方式组成酶：组成酶：细胞所固有的酶细胞所固有的酶诱导酶：诱导酶：在诱导物的诱导作用下合成的酶在诱导物的诱导作用下合成的酶诱导物诱导物 底物、产物、底物结构类似物（底物、产物、底物结构类似物（IPTGIPTG）诱导诱导作用作用协同诱导：协同诱导：诱导物同时诱导几种酶的合成诱导物同时诱导几种酶的合成顺序诱导：顺序诱导：先后诱导不同酶的合成先后诱导不同酶的合成生物学意

24、义：生物学意义： 节约机制；节约机制； 环境适应能力环境适应能力36尾产物阻遏：尾产物阻遏：指有些酶当它们的作用产物积指有些酶当它们的作用产物积累到一定浓度，并能满足机体需要后，它们累到一定浓度，并能满足机体需要后，它们的合成受阻。阻遏蛋白本身不与操纵子结合，的合成受阻。阻遏蛋白本身不与操纵子结合，但它能以酶作用产物为效应物（辅阻遏物）但它能以酶作用产物为效应物（辅阻遏物）并与之结合产生别构，变为能与操纵子结合并与之结合产生别构，变为能与操纵子结合而关闭了结构基因。而关闭了结构基因。(1)(1)酶的合成调控机制阴遏酶的合成调控机制阴遏37尾产物阻遏尾产物阻遏ABCDEE1E2E3E438代谢产

25、物阻遏：代谢产物阻遏：指当细胞在容易利用的指当细胞在容易利用的碳碳源源上上( (葡萄糖葡萄糖) )生长时，有些酶，特别是参与分生长时，有些酶，特别是参与分解代谢的酶类的合成受阻。解代谢的酶类的合成受阻。( (葡萄糖的分解物葡萄糖的分解物引起细胞内引起细胞内cAMPcAMP含量降低，启动子释放含量降低，启动子释放cAMPcAMP- -CAPCAP蛋白，蛋白，RNARNA聚合酶不能与乳糖的启动基因聚合酶不能与乳糖的启动基因结合，以至转录不能发生结合，以至转录不能发生，直到葡萄糖被利，直到葡萄糖被利用完后，乳糖操纵子才进行转录，形成利用用完后，乳糖操纵子才进行转录，形成利用乳糖的酶，这种现象称葡萄糖

26、效应乳糖的酶，这种现象称葡萄糖效应) )。(1)(1)酶的合成调控机制阴遏酶的合成调控机制阴遏39 葡萄糖效应：葡萄糖效应：葡萄糖抑制微生物利用其他葡萄糖抑制微生物利用其他碳源碳源( (底物底物) )的现象。的现象。IPOZYAcAMP-CAP代谢产物阻遏代谢产物阻遏40（1 1）乳糖操纵子的结构）乳糖操纵子的结构IPOZYA- -半乳糖苷酶半乳糖苷酶透过酶透过酶乙酰基转移酶乙酰基转移酶诱导物诱导物阻遏蛋白阻遏蛋白cAMP-CAPRNA聚合酶聚合酶mRNA（2 2）阻遏蛋白的负性调节；）阻遏蛋白的负性调节；（3 3）CAP的正性调节的正性调节乳糖操纵子的诱导机制：乳糖操纵子的诱导机制：DNA乳

27、糖操纵子学说乳糖操纵子学说41磷酸核糖邻氨基苯甲酸磷酸核糖邻氨基苯甲酸分支酸分支酸邻氨基苯甲酸邻氨基苯甲酸羧苯氨基脱氧核糖磷酸羧苯氨基脱氧核糖磷酸吲哚甘油磷酸吲哚甘油磷酸色氨酸色氨酸邻氨基苯甲酸合酶邻氨基苯甲酸合酶邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶吲哚甘油磷酸合酶吲哚甘油磷酸合酶色氨酸合酶色氨酸合酶色氨酸操纵子学说色氨酸操纵子学说42色氨酸操纵子学说色氨酸操纵子学说色氨酸操纵子负责调控色氨酸的生色氨酸操纵子负责调控色氨酸的生物合成，物合成，当培养基中有足够的色氨酸时，当培养基中有足够的色氨酸时，该操纵子自动关闭该操纵子自动关

28、闭；缺乏色氨酸时，操缺乏色氨酸时，操纵子被打开纵子被打开。色氨酸操纵子恰和乳糖操。色氨酸操纵子恰和乳糖操纵子相反。纵子相反。431. 1. 色氨酸操纵子的调节作用色氨酸操纵子的调节作用RPODBACE阻遏蛋白原阻遏蛋白原辅阻遏物辅阻遏物（色氨酸）（色氨酸）mRNADNA442. 2. 衰减子的调节作用衰减子的调节作用RPODBACE低色氨酸低色氨酸高色氨酸高色氨酸前导序列前导序列4321DNA12435/ - mRNAPr432145(2)(2)打破酶合成调节机制的方法打破酶合成调节机制的方法添加诱导物：酶的作用底物或类似物及诱添加诱导物：酶的作用底物或类似物及诱导物的前体物质导物的前体物质

29、通过降低阻遏物浓度提高酶产量通过降低阻遏物浓度提高酶产量 基因突变和基因重组：物理、化学、基因基因突变和基因重组：物理、化学、基因工程工程 添加表面活性剂：土温、油酸添加表面活性剂：土温、油酸提高酶发酵产量的方法提高酶发酵产量的方法* 46酶的分离纯化酶的分离纯化 酶蛋白的获得大致经历：提取、分离、纯酶蛋白的获得大致经历：提取、分离、纯化及鉴定几个关键技术环节。化及鉴定几个关键技术环节。 酶可分为酶可分为胞外酶胞外酶与与胞内酶胞内酶，对于胞外酶提，对于胞外酶提取相对方便的多，而胞内酶的提取需将细取相对方便的多，而胞内酶的提取需将细胞破碎后再提取。如许多与基因表达相关胞破碎后再提取。如许多与基因

30、表达相关的酶和蛋白质要破碎细胞核才能提取。的酶和蛋白质要破碎细胞核才能提取。 47酶的纯化应注意的问题酶的纯化应注意的问题 要注意防止酶的变性失活（温度、要注意防止酶的变性失活（温度、pHpH值、值、泡沫、重金属、有机溶液、微生物等）。泡沫、重金属、有机溶液、微生物等）。 酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能除去。质尽可能除去。 可以纯化过程中检测酶活。可以纯化过程中检测酶活。48 得到酶的粗提物后，可采用生化物质分离得到酶的粗提物后，可采用生化物质分离沉淀技术进一步得到部分纯化的酶制品。沉淀技术进一步得到部分纯化的酶制品。 等电点沉淀法（等电点沉淀

31、法（pI处净电荷为零）处净电荷为零） 有机溶剂沉淀法（乙醇、丙酮）有机溶剂沉淀法（乙醇、丙酮） 聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法(PEG6000(PEG6000，空间排阻学说，空间排阻学说) ) 盐析法盐析法( (低浓度的中性盐：盐溶低浓度的中性盐：盐溶盐析，盐析，pH、温度、电解质类型、蛋白质浓度温度、电解质类型、蛋白质浓度) )。 酶的分离纯化酶的分离纯化49分离蛋白质的技术可用于分离纯化酶。分离蛋白质的技术可用于分离纯化酶。 普通的分离纯化方法有：普通的分离纯化方法有： 凝胶过滤法凝胶过滤法( (液体柱层析法液体柱层析法) )，是根据样品中，是根据样品中各种物质各种物质分子量分子量的不同，将

32、样品的不同，将样品通过多孔凝通过多孔凝胶床来达到分离的目的。几种主要的凝胶为胶床来达到分离的目的。几种主要的凝胶为交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶(Sephadex(Sephadex) )、聚丙烯酰胺凝、聚丙烯酰胺凝胶胶(Bio-Gel P)(Bio-Gel P)、琼脂糖凝胶、琼脂糖凝胶(Sepharose(Sepharose，Bio-Gel A)Bio-Gel A)50吸附层析（吸附层析（Adsorption ChromatographyAdsorption Chromatography） 它是一种常用的分离酶蛋白的技术。以前常用磷它是一种常用的分离酶蛋白的技术。以前常用磷酸钙凝胶、白土类纤维素

33、及淀粉等作吸附剂，其酸钙凝胶、白土类纤维素及淀粉等作吸附剂，其主要原理是根据物质对活性物体表面主要原理是根据物质对活性物体表面吸附亲和力吸附亲和力的差异的差异来分离。来分离。 吸附层析材料吸附层析材料: : 羟基磷灰石羟基磷灰石 它它对核酸类物质有较强的吸附能力对核酸类物质有较强的吸附能力，装柱后流速，装柱后流速很好，其表面上有很好，其表面上有CaCa2+2+及及POPO4 43-3-两种带电基团，从两种带电基团，从而使酸性蛋白质和中性蛋白质可与其上的而使酸性蛋白质和中性蛋白质可与其上的CaCa2+2+结结合，再用合，再用pH6.8pH6.8的的0.030.030.12mol/L0.12mol

34、/L磷酸缓冲液洗磷酸缓冲液洗脱即可。而碱性蛋白质可与其上的脱即可。而碱性蛋白质可与其上的POPO4 43-3- - -基团结基团结合，也可用合，也可用pH6.8pH6.8的的0.120.120.23mol/L0.23mol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液洗脱）。洗脱）。51亲合层析（亲合层析（Affinity ChromatographyAffinity Chromatography） 利用生物大分子和固定相表面存在的某种利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力特异性亲和力，进行选择性分离。，进行选择性分离。 酶分子能和其专一的底物、抑制剂、辅因酶分子能和其专一的底物、抑制剂、辅因子或效应物通

35、过某些次级键相互结合形成子或效应物通过某些次级键相互结合形成中间复合物。称这类专一结合的分子为中间复合物。称这类专一结合的分子为配配基基（LigandLigand）；）； 生物高分子和配基之间形成中间复合物的生物高分子和配基之间形成中间复合物的能力，称为亲合力（能力，称为亲合力（AffinityAffinity）。）。 亲合层析具有纯化效果好、得率高的特点亲合层析具有纯化效果好、得率高的特点5253基于上述原理，首先选用一种惰性支持物基于上述原理，首先选用一种惰性支持物作为作为载体载体，再选一个能与酶专一性结合的，再选一个能与酶专一性结合的化合物作为化合物作为配基配基，再，再将二者偶联制成亲合

36、将二者偶联制成亲合吸附剂吸附剂。 配基可以是目的酶的竞争性抑制剂、底物、配基可以是目的酶的竞争性抑制剂、底物、辅因子、抗体等。辅因子、抗体等。 装成亲合吸附剂后，当含有目的酶的混合装成亲合吸附剂后，当含有目的酶的混合物通过此柱时，物通过此柱时，只有与配基有专一亲合力只有与配基有专一亲合力的那种酶才能被吸附到柱上的那种酶才能被吸附到柱上，其余无关的，其余无关的部分均随溶剂从柱内无阻地通过。部分均随溶剂从柱内无阻地通过。54亲合吸附剂的制备亲合吸附剂的制备:-:-载体载体(1)(1)理想载体应具备的条件：理想载体应具备的条件： 均一、坚实、多孔的网状结构，使其在连接配均一、坚实、多孔的网状结构，使

37、其在连接配基后，仍有比较大的表面和良好的流动性；基后，仍有比较大的表面和良好的流动性； 亲水性的惰性物质，对蛋白质没有非特异性吸亲水性的惰性物质，对蛋白质没有非特异性吸附；附；一定条件下可被活化和改变的各种化学基团，一定条件下可被活化和改变的各种化学基团，以便可偶联各式各样的配基；以便可偶联各式各样的配基； 具有良好的化学稳定性。具有良好的化学稳定性。55(2)(2)最常用的惰性支持物：最常用的惰性支持物：琼脂糖琼脂糖，商品，商品名为名为Sapharose或或Bio-Gel A。其它载体有：。其它载体有：交联葡聚糖、交联葡聚糖、 Bio-Gel P、多孔玻璃等。、多孔玻璃等。 配基：配基：选择

38、配基时，首先要对目的酶的生选择配基时，首先要对目的酶的生化特性及动力学性质了解清楚，配基应能化特性及动力学性质了解清楚，配基应能与目的酶发生专一性结合，但又不被作用与目的酶发生专一性结合，但又不被作用生成新的产物。生成新的产物。 偶联：偶联：载体本身没有活性基团，要先活化、载体本身没有活性基团，要先活化、引入引入“手臂手臂”、再接配基。、再接配基。561 1 酶工程概述酶工程概述2 2 酶的生产与分离纯化酶的生产与分离纯化3 3 酶的化学修饰酶的化学修饰4 4 酶的固定化酶的固定化5 5 酶反应器与酶传感器酶反应器与酶传感器6 6 酶在食品工业中的应用酶在食品工业中的应用酶工程与食品产业酶工程

39、与食品产业573 3 酶的化学修饰酶的化学修饰酶化学修饰的原因酶化学修饰的原因*：酶稳定性不够，不能适应大量生产的需要酶稳定性不够，不能适应大量生产的需要酶作用的最适条件不符酶作用的最适条件不符酶的主要动力学性质的不适应酶的主要动力学性质的不适应临床应用的特殊要求临床应用的特殊要求58酶化学修饰的基本原理酶化学修饰的基本原理*1 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性2 如何保护酶活性部位与抗抑制剂如何保护酶活性部位与抗抑制剂3 如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶水解酶4 如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境如何消除酶的抗原性

40、及稳定酶的微环境59u化学修饰的定义：化学修饰的定义：指通过酶分子的改造指通过酶分子的改造以达到结构改性的目的，又称以达到结构改性的目的，又称“生物分生物分子工程子工程”。u按修饰方法及部位不同，酶分子的这种按修饰方法及部位不同，酶分子的这种体外改造又可分为体外改造又可分为酶的表面修饰酶的表面修饰和和酶的酶的内部修饰内部修饰。酶的化学修饰酶的化学修饰60酶的表面修饰酶的表面修饰l酶分子侧链基团的化学修饰酶分子侧链基团的化学修饰巯基的化学修饰：巯基的化学修饰：巯基具有很强的亲核性，采用巯基化学修饰巯基具有很强的亲核性，采用巯基化学修饰 剂与酶蛋白侧链上的巯基结合，使巯基发生改剂与酶蛋白侧链上的巯

41、基结合，使巯基发生改变，从而改变酶的空间构象、特性和功能。变，从而改变酶的空间构象、特性和功能。常用修饰剂：烷基化剂、酰化基、马来酰亚胺常用修饰剂：烷基化剂、酰化基、马来酰亚胺61巯基化学修饰举例巯基化学修饰举例： 马肝醇脱氢酶马肝醇脱氢酶(HLADH)(HLADH)的的Lys乙基化、乙基化、糖基化和甲基化都能增加其活力，其糖基化和甲基化都能增加其活力，其中甲基化使酶活力增加最大，同时酶中甲基化使酶活力增加最大，同时酶的稳定性也提高了。的稳定性也提高了。62l有机大分子对酶的修饰有机大分子对酶的修饰概念：概念：指利用水溶性大分子与酶结合，使酶指利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精

42、细的改变，从而改变的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰大分子结合修饰法法，简称为大分子结合法。，简称为大分子结合法。 63常用的水溶性大分子修饰剂：常用的水溶性大分子修饰剂：糖及糖的衍生物：聚乙二醇糖及糖的衍生物：聚乙二醇(PEG)(PEG)生物活性大分子：肝素生物活性大分子：肝素具有生物活性的大分子物质：乙烯酮具有生物活性的大分子物质：乙烯酮举例：举例： 精氨酸酶经精氨酸酶经PEGPEG结合修饰结合修饰 PEGPEG对色氨酸酶进行修饰对色氨酸酶进行修饰 PEGPEG结合修饰后的结合修饰后的L-L-天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶64酶分

43、子的内部修饰酶分子的内部修饰(1)(1)非催化活性基团的修饰非催化活性基团的修饰被修饰的残基可以是亲核的被修饰的残基可以是亲核的(Ser(Ser、CysCys、MetMet、His)His)，也可以是新电子的，也可以是新电子的(Tyr(Tyr、TrpTrp) )，还可以是可氧化的还可以是可氧化的(Tyr(Tyr、TrpTrp、 Met)Met)。对这。对这类非催化残基的修饰可改变酶的动力学性态，类非催化残基的修饰可改变酶的动力学性态，改变酶的束缚能力。改变酶的束缚能力。65酶分子的内部修饰酶分子的内部修饰(1)(1)非催化活性基团的修饰非催化活性基团的修饰例如：将胰凝乳蛋白酶的例如：将胰凝乳蛋

44、白酶的MetMet192192氧化亚砜，氧化亚砜，则使该酶对含芳香族或大体积脂肪族取代基则使该酶对含芳香族或大体积脂肪族取代基的专一性底物的的专一性底物的KmKm值不变，这说明值不变，这说明MetMet192192与酶与酶对专一性底物的束缚有关，也说明底物的非对专一性底物的束缚有关，也说明底物的非反应部束缚，在酶的催化作用中有重要作用。反应部束缚，在酶的催化作用中有重要作用。66(2)(2)催化活性基团的修饰催化活性基团的修饰指通过选择性修饰氨基酸侧链成分，来指通过选择性修饰氨基酸侧链成分，来实现氨基酸的取代，这种将一种氨基酸侧链实现氨基酸的取代，这种将一种氨基酸侧链转化为另一种新的氨基酸侧链

45、的方法叫化学转化为另一种新的氨基酸侧链的方法叫化学突变法。突变法。酶分子的内部修饰酶分子的内部修饰67(2)(2)催化活性基团的修饰催化活性基团的修饰例如：例如：BerderBerder等人将枯草杆菌蛋白酶活等人将枯草杆菌蛋白酶活性部位的性部位的SerSer残基转化为残基转化为CysCys残基，新产生的残基，新产生的巯基蛋白酶对肽或脂没有水解能力，但能水巯基蛋白酶对肽或脂没有水解能力，但能水解高度活化的底物如硝基苯酯。解高度活化的底物如硝基苯酯。酶分子的内部修饰酶分子的内部修饰68(3)(3)酶蛋白主链修饰酶蛋白主链修饰 酶蛋白主链修饰主要是靠酶法。例如：将酶蛋白主链修饰主要是靠酶法。例如：将

46、ATPATP酶用胰蛋白酶有限水解，切除其十几个残酶用胰蛋白酶有限水解，切除其十几个残基后，酶活力提高了基后，酶活力提高了5.55.5倍。倍。酶分子的内部修饰酶分子的内部修饰69与辅因子有关的修饰与辅因子有关的修饰依赖辅因子的酶的修饰：依赖辅因子的酶的修饰：方法一：方法一：如果辅因子与酶是非共价结合，则可将如果辅因子与酶是非共价结合，则可将辅因子共价结合于酶上。如辅因子共价结合于酶上。如NADNAD衍生物共价结衍生物共价结合到醇脱氢酶上后，酶仍具催化活性构象。合到醇脱氢酶上后，酶仍具催化活性构象。方法二：方法二：引入新的具有强反应的辅因子，巯基专引入新的具有强反应的辅因子，巯基专一性试剂能改变某

47、些依赖黄素的氧化酶所催化一性试剂能改变某些依赖黄素的氧化酶所催化的反应。如经药物处理处理黄嘌呤脱氢酶，可的反应。如经药物处理处理黄嘌呤脱氢酶，可转化为黄嘌呤氧化酶。转化为黄嘌呤氧化酶。70金属酶的金属取代：金属酶的金属取代：酶分子中的金属取代可以改变酶的专一酶分子中的金属取代可以改变酶的专一性，稳定性及其抑制作用。如酰化氨基酸水性，稳定性及其抑制作用。如酰化氨基酸水解酶活性部位中的解酶活性部位中的ZnZn被被CoCo取代后，酶最适取代后，酶最适pHpH值为和底物专一性都有改变。值为和底物专一性都有改变。与辅因子有关的修饰与辅因子有关的修饰71化学人工酶化学人工酶概念：概念：根据酶的催化原理，模

48、拟酶的生物根据酶的催化原理，模拟酶的生物催化功能，用有机化学和生物学的方法合催化功能，用有机化学和生物学的方法合成具有专一催化功能的酶的模拟物人工成具有专一催化功能的酶的模拟物人工酶。（酶。（arti-ficial ebzyme）。）。化学人工酶的制作有两种：化学人工酶的制作有两种：半合成酶半合成酶和和全全合成酶合成酶。72半合成酶半合成酶将具有一定结构和功能的物质与特异的蛋将具有一定结构和功能的物质与特异的蛋白质相结合，便可形成新的生物催化剂白质相结合，便可形成新的生物催化剂半合成酶。半合成酶。与金属或金属有机物的结合与金属或金属有机物的结合 例如：美国和以色列的两位学者将钌电子例如：美国和

49、以色列的两位学者将钌电子传递催化剂与巨头鲸肌红蛋白结合，产生传递催化剂与巨头鲸肌红蛋白结合，产生一种一种“半合成的无机生物酶半合成的无机生物酶”。73半合成酶半合成酶与特异性的物质结合与特异性的物质结合 例如：美国加州大学的一个研究小组，将例如：美国加州大学的一个研究小组，将一段人工合成的寡聚核苷酸链经化学方法一段人工合成的寡聚核苷酸链经化学方法处理，连接到处理，连接到RNARNA酶酶166166位的位的CysCys上，获得的上，获得的半合成酶借寡核苷酸的碱基互补关系，显半合成酶借寡核苷酸的碱基互补关系，显示了对示了对RNARNA链特定位点的水解作用，从而创链特定位点的水解作用，从而创造了第一

50、个造了第一个“RNA”RNA”限制性内切酶。限制性内切酶。74全合成酶全合成酶这类人工酶不是蛋白质，而是有机物，这类人工酶不是蛋白质，而是有机物，通过加入酶的催化基团与控制空间的构象，通过加入酶的催化基团与控制空间的构象，像自然酶那样能选择性地催化化学反应，包像自然酶那样能选择性地催化化学反应，包括小分子有机物括小分子有机物( (金属络合物金属络合物) )、抗体酶、抗体酶( (催催化抗体化抗体) )和人工聚合酶。和人工聚合酶。75小分子有机物全合成酶小分子有机物全合成酶 利用各种有机分子利用各种有机分子( (如如- -环糊精等环糊精等) )和金属和金属离子成功地水解、氧化还原、转氨等合成离子成

51、功地水解、氧化还原、转氨等合成酶。例如，转氨全合成酶：酶。例如，转氨全合成酶：GlyGly与与AlaAla的西的西佛碱的佛碱的CuCu（）络合物。）络合物。全合成酶全合成酶76人工聚合物酶人工聚合物酶 用分子印迹技术制备的人工酶，其制备原用分子印迹技术制备的人工酶，其制备原理与抗体酶相同，只是用人工聚合物代替理与抗体酶相同，只是用人工聚合物代替抗体。抗体。全合成酶全合成酶77抗体酶抗体酶抗体酶：抗体酶：是一种具有催化功能的抗体分子，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。在其可变区赋予了酶的属性。酶与抗体的区别：酶与抗体的区别：酶是能与反应过渡态选择酶是能与反应过渡态选择结合的

52、催化性物质，抗体是和基态分子结合结合的催化性物质，抗体是和基态分子结合的催化性物质。的催化性物质。78抗体酶的制备方法抗体酶的制备方法诱导法：诱导法：即用设计好的半抗原，通过间隔链与即用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白（例如牛血清白蛋白等）偶联制成抗载体蛋白（例如牛血清白蛋白等）偶联制成抗原，然后采用标准的单克隆抗体来制备、分离、原，然后采用标准的单克隆抗体来制备、分离、筛选抗体酶。筛选抗体酶。79引入法：引入法：将催化基团或辅助因子引入到抗体的将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，可采用选择性化学修饰方法，抗原结合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可利用蛋白质工程和基因工程技术。

53、亦可利用蛋白质工程和基因工程技术。抗体酶的制备方法抗体酶的制备方法80拷贝法：拷贝法：用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，应获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，应获得具有原来酶活性的抗体酶。得具有原来酶活性的抗体酶。缺点：缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶。产生新酶。抗体酶的制备方法抗体酶的制备方法81分子印迹分子印迹：制备对某一化合物具有选择性的制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程。聚合物的过程。

54、分子印迹酶分子印迹酶1 选定印迹分子和功选定印迹分子和功能单体，使二者发能单体，使二者发生互补反应；生互补反应；2 在印迹分子在印迹分子-单体单体复合物周围发生聚复合物周围发生聚合反应；合反应；3 用抽提法从聚合物用抽提法从聚合物中除掉印迹分子。中除掉印迹分子。82分子印迹酶分子印迹酶l通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可以在结合部位的空腔内诱导产生用，并可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。催化基团，并与底物定向排列。l性质：性质：遵循米氏方程，催化活力依赖

55、反应遵循米氏方程，催化活力依赖反应速度常数。速度常数。831 1 酶工程概述酶工程概述2 2 酶的生产与分离纯化酶的生产与分离纯化3 3 酶的化学修饰酶的化学修饰4 4 酶的固定化酶的固定化5 5 酶反应器与酶传感器酶反应器与酶传感器6 6 酶在食品工业中的应用酶在食品工业中的应用酶工程与食品产业酶工程与食品产业844 酶的固定化酶的固定化固定化酶与自由酶的概念固定化酶与自由酶的概念*： 自由酶自由酶( (Free Enzyme) )：酶直接加入溶液：酶直接加入溶液中，酶自身的空间结构不发生改变，保持中，酶自身的空间结构不发生改变，保持自己的生物特性。自己的生物特性。固定化酶固定化酶( (Im

56、mobilized Enzyme) )：通过：通过物理或化学的手段，将酶固载在某种基体物理或化学的手段，将酶固载在某种基体上，再加入溶液中。上，再加入溶液中。85固定化酶的发展史固定化酶的发展史 19531953年出现了固定化酶技术。年出现了固定化酶技术。 19711971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用用“固定化酶固定化酶”的名称。的名称。 6060年代开始：酶的固定化方法研究。年代开始：酶的固定化方法研究。 近年来：固定化方法和载体开发。近年来：固定化方法和载体开发。 转向它在工业、医药、化学分析、亲和层析、转向它在工业、医药、化学分析、亲和层析、

57、环境保护、能源开发以及理论研究等方面的应环境保护、能源开发以及理论研究等方面的应用研究。用研究。 86固定化酶的优点固定化酶的优点* 易于将酶与底物及产物分离，因而其产物相对易于将酶与底物及产物分离，因而其产物相对容易提纯；容易提纯； 酶能够重复利用，使用效率提高，成本低；酶能够重复利用，使用效率提高，成本低； 大多数情况下可以提高酶的稳定性；大多数情况下可以提高酶的稳定性； 可以增加产物的得率，提高产物质量；可以增加产物的得率，提高产物质量； 有利于实现管道化、连续化以及自动化操作，有利于实现管道化、连续化以及自动化操作，易于和各种分离手段联用。易于和各种分离手段联用。 87固定化酶的缺点固

58、定化酶的缺点* 由于固定化酶是通过反应而被结合在载体上，由于固定化酶是通过反应而被结合在载体上，固定化过程中酶的活力难免有一定的损失；固定化过程中酶的活力难免有一定的损失； 酶的底物要求是水溶性的，这样才能够接触酶酶的底物要求是水溶性的，这样才能够接触酶而发生反应；而发生反应； 不适宜于需要辅助因子的反应。不适宜于需要辅助因子的反应。88l吸附法吸附法l包埋法包埋法l共价键结合法共价键结合法l交联法交联法固定化酶的方法固定化酶的方法* 89吸附法分为吸附法分为物理吸附法物理吸附法和和离子交换吸附法离子交换吸附法。 (1)(1)物理吸附法：物理吸附法：通过氢键、疏水作用和通过氢键、疏水作用和电子

59、电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上，从而制成固定化酶。常用的载体有：从而制成固定化酶。常用的载体有： 有机载体：有机载体：纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉。如：木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶吸附后在淀粉。如：木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶吸附后在载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约70mg/cm70mg/cm2 2。l吸附法吸附法90(1)(1)物理吸附法：物理吸附法： 无机载体：无机载体：氧化铅、皂土、白土、高岭土、多氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。如：用多孔硅为载体吸

60、附孔玻璃、二氧化钛等。如：用多孔硅为载体吸附米曲霉和枯草杆菌的淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，米曲霉和枯草杆菌的淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在在4545进行固定化，用高浓度的底物进行连续反进行固定化，用高浓度的底物进行连续反应半衰期分别为应半衰期分别为1414、3535、60d60d。无机载体的吸。无机载体的吸附容量较低、而且酶容易脱落。附容量较低、而且酶容易脱落。 l吸附法吸附法91(2)(2)离子交换吸附法：离子交换吸附法：将酶与含有离子交换基将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。 酶吸附较牢，在工业上颇具广泛用途。常用酶吸附较牢，