NO供体异黄酮类化合物的合成及其表征

1、NO供体异黄酮类化合物的合成及其表征 2004级药学本科  劳世鑫      指导老师  李芳耀摘要： 目的：设计合成了两个一氧化氮(NO)供体异黄酮类化合物，以期寻找新型具有NO供体活性化合物。方法：以苯乙酸、间苯二酚、DMF等为原料合成7-羟基-4-甲氧基异黄酮，以其为母体使羟基与NO供体片段相连，得到一氧化氮(NO)供体型异黄酮类衍生物。 结果与结论：合成2种目标产物(VII-1、VII-2)，产物的结构经IR、1H-NMR、13C-NMR、MS确证，其活性测定有待研究。关键词：一氧化氮；异黄酮；供体；化学合成Synthesis and

2、Characterization of Isoflavones withNO DonorsUndergraduate Pharmaceutical of 2004 : Lao ShixinInstructor : Li FangyaoAbstract : Aim To design and synthesize two isoflavones with NO donors ,and to search new type of active compounds with NO donors. Methods Two isoflavones were synthesize by using raw

3、 materials of phenylacetic acid, hydroxyphenol and DMF . and their anti-inflammatory activity against xylene- induced ear edema in mice in vivo and anti-hypertensive activity were tested. Results and conclusion Two new type of the target compounds (VII-1、VII-2)were synthesized and characterized by I

4、R、1H-NMR、13C-NMR、MS. the activity of isoflavones with NO donors should haven being studied .Key words : Nitric Oxide ; isoflavones ; NO donor ; chemical synthesis ; isoflavones; 一氧化氮(NO)是体内一种重要的细胞信使分子和效应分子，在体内由NO前体物质L2精氨酸(L2Arg)在一氧化氮合酶(NOS) 的催化下与氧分子作用产生NO 和L2胍氨酸，参与调节多种生理功能，具有重要的生理和药理作用, 体内NO不足可引发高血压

5、、动脉粥样硬化、冠心病、急性心肌梗塞、肺肾疾病以及男性性功能异常等疾病。许多急慢性疾病会抑制体内NO的生成，而向循环系统或局部组织输入一定量的NO供体以补充组织中NO的不足，在短时间内可收到显著的效果。由于NO对于疾病的预防和治疗有重要意义，对外源性NO供体的研究引起全球科学家的广泛兴趣。20世纪90年代后，NO在医药方面所显示出的巨大潜力吸引了全世界许多著名大学和科研单位从事这方面的基础研究,并逐渐成为生命科学和医药研究的热点和前沿之一，美国心脏学会主席Fuster在谈到3位美国科学家因研究NO而获得1998年诺贝尔奖时说：“NO及其功能的发现是医学史上的最伟大事件之一”。 可以说，20世纪

6、对NO供体型药物的研究已为新药发现开辟了一条新的途径。至今，世界上已有70多种NO供体药物获得专利并在临床上得到应用。NO供体是一类能在体内释放出NO的前体药物,是指不需经NOS 催化自行或与其它物质作用产生NO 的物质。现已发现多种结构类型的NO供体,但较为重要的是硝酸酯、亚硝基硫醇、呋咱N2氧化物、偶氮二醇盐、三唑252亚胺等几类15。而NO供体型药物15主要是以已知药物或活性化合物的结构为母核，与NO供体通过各种连接基团结合而成的前药，它可在体内经相关酶或非酶作用释放原药和NO。研究表明，由于释放NO的作用,NO供体型药物的疗效一般优于原药，且不良反应显著小于原药。目前研究的NO供体，如

7、亚硝基硫醇类和有机硝酸酯类就分别存在稳定性差和需细胞代谢产生耐受性等缺点。理想的NO供体应具备自发稳定的释放NO，无需细胞代谢,不生成其他有害物质，长时间作用无耐受性，便于控制等性能16。近年来NO供体药物研究的一个创新性发展是将NO供体部分与目前有效的心血管药物结合起来，即结合型NO 供体药物。其研究的趋势是利用前药原理将NO 供体与生效药物结合起来形成一种更有效的结合型新药物。这种药物设计方式的优点在于提高药物的生物利用度、增加药物稳定性、减小毒副作用、促使药物长效化等15。例如NO供体型非甾体抗炎化合物分子的设计思路一般是将一些疗效确切的传统NSAIDs和NO供体通过一些连接基团(spa

8、cer)相连而成，常用的NSAIDs是一些含羧基或烯醇羟基的药物,如阿司匹林、双氯芬酸、布洛芬、萘普生、吡罗昔康等;NO供体包括硝酸酯、亚硝酸酯、亚硝基硫醇等,其中最常用的是硝酸酯;NSAIDs和NO供体常用脂肪烃基或芳香烃基通过酯键或酰胺键连接起来4。根据这种科学研究方法，我们将NO 供体结构引入具有多种生理活性的异黄酮类药物中,结合形成NO 供体型异黄酮类药物,体内前药原理在释放NO 供体和异黄酮类物质，将具有双重的药理和生理作用，目前有关NO 供体型异黄酮类药物的合成及生理活性的研究未见报道，因此本文的研究是寻找NO 供体新药的一次全新尝试。异黄酮是广泛存在于豆类植物中的植物雌激素,能够

9、调整人体的内分泌功能，防治妇女更年期综合征，降低血脂，减少冠心病的发生，防治骨质疏松症,抗癌，并能止痛消肿5。自20世纪80年代美国科学家发现大豆中抑制癌细胞的异黄酮后, 国际上掀起了研究异黄酮的热潮, 至今已经取得很大进展, 筛选出多种生理活性的异黄酮类物质17。在抗肿瘤作用研究中，实验证明异黄酮类化合物如染料木素、大豆苷元、鸡豆黄素A 等具有良好抗肿瘤活性, 是一种很有潜力的肿瘤化学预防剂和治疗剂, 具有广泛的应用前景17。在心血管疾病中，动脉粥样硬化是危害人体健康极为严重的病症，而高血脂症是其危害因素之一。天然存在的异黄酮类化合物能显著降低血中胆固醇和甘油三酯的含量，可能成为一类比较有前

10、途的防治动脉粥样硬化的化合物18。异黄酮的制备主要有提取法和化学合成法两种。然而，随着人们对健康的要求也越来越高，仅靠从天然的植物中提取已远不能满足市场的需求，而且植物中异黄酮类物质的含量随地域有很大差异，且从植物中提纯异黄酮的难度很大，另外其消化、吸收受多种因素的影响2。所以，化学合成黄酮类物质日益引起化学家和药物学家的广泛关注。化学合成法与提取法相比，可以探索从简单原料出发，经酰化、重排等方法制备，具有生产成本低、工艺简单、产率高、纯度高等诸多优点，是一种获取异黄酮类化合物的好方法3。目前异黄酮的化学合成方法主要有苯基苄基酮路线、重排反应法、微波法等方法2。苯基苄基酮路线2:通过(取代)苯

11、乙酸(或者苯乙腈)的酰化反应先生成2一羟基苯基苄基酮，再环合得异黄酮。合成路线如下：在酰化反应和环合反应方面，科学家们已做了大量工作，经典的方法有：Hoesch法(苯乙腈路线)，Kenjifukui法(苯乙酸路线)。除了经典的合成方法以外，人们积极探索出新的方法和手段，其中以“一锅法”2为代表的一些方法具有原料易得、反应高效、方便等优点，随着异黄酮及其衍生物研究的深入和应用领域的扩大，还会有新的试剂和方法用于它们的合成，从而彻底解决目前异黄酮类物质资源缺乏的问题。因此，一氧化氮(NO) 供体型异黄酮类药物的化学合成方法有待研究。 本课题采用化学合成方法，以对甲氧基苯乙酸、间苯二酚做原料，在三氟

12、化硼-乙醚作溶剂和催化剂的体系中1，实现了酰化和“一锅煮”合成7-羟基-4-甲氧基异黄酮(V)，以此为母体，使7位羟基与一氧化氮供体片段相连，合成两个一氧化氮(NO) 供体型异黄酮类衍生物4 、7 、14，即7-（2-硝基氧基）乙氧基-4-甲氧基异黄酮（VI-1）及7-（3-硝基氧基）丙氧基-4-甲氧基异黄酮（VII-2），产物的结构经 IR、1H-NMR、13C-NMR、MS 及元素分析确证。1. 合成路线：1.1 7-羟基-4-甲氧基异黄酮（4）的合成1.2 7-（2-硝基氧基）乙氧基-4-甲氧基异黄酮（6a）的合成1.3 7-（3-硝基氧基）丙氧基-4-甲氧基异黄酮（6b）的合成

13、0;2. 实验仪器和试剂试剂：   对甲氧基苯乙酸(分析纯，广州化工二厂)、间苯二酚（分析纯，成都科龙化学试剂厂）、1，2-二溴乙烷（化学纯，2.166-2.176 g/ml,成都科龙化学试剂厂）、1，3-二溴丙烷（化学纯，1.980-1.998 g/ml,中国医药集团上海化工）、AgNO3（分析纯，天津天茂化学试剂厂）旋转蒸发仪：  R-201  郑州长城科工贸有限公司数字熔点仪：  WRS-1A  上海精密科学仪器有限公司超声波清洗仪：  KQ-2200B  巩义市英裕予华仪器厂集热式恒温磁力搅拌仪： DF-1

14、01S  巩义市英裕予华仪器厂三用紫外分析仪： ZF7 巩义市英裕予华仪器有限责任公司傅立叶变换红外光谱仪:Nicolet ESP 360型(美国)超导核磁共振仪:AVANCE AV 500 (瑞士, 布鲁克公司)元素分析仪:PE2400(美国, 珀金埃尔默公司) 型质谱分析仪:SHIMADZU QP5050A(日本) 3. 方法与结果3.1 7-羟基-4-甲氧基异黄酮（4）的合成 间苯二酚22g(0.20 mol）和对甲氧基苯乙酸（0.20 mol）溶于70mlBF3/Et20中，80下搅拌反应6h，生成脱氧安息香.（TLC跟踪反应进程）冷却至10，加入DMF（300ml）和BF3

15、/Et2O（100 ml），升温至50，滴加干燥的甲基磺酰氯（70 ml）和DMF（100 ml）混合液，升温至78反应3 h，反应后冷却物倒入大量碎冰中，得一浅棕红色溶液。过滤收集固体，真空干燥后，得到浅红色粉末42.2 g，收率为78.70，mp 256.7260.0，TLC（Rf=0.19 ：石油醚/乙酸乙酯 = 2/1 ）。3.2 7-溴乙氧基-4-甲氧基异黄酮(5a)的合成 7-羟基-4-甲氧基异黄酮5.5g（ 0.02mol）,无水 K2CO3 5.6g和17ml(0.20mol) 1, 2 -二溴乙烷加入到50ml的DMF与200ml的丙酮的混合液中，加热到6

16、0，回流反应24h(TLC跟踪反应进程)，反应完成后，冷却至室温，减压过滤，滤液经减压蒸除丙酮和1,2-二溴乙烷至浓缩液，过滤，滤饼用水和少量乙醇洗涤后收集，滤液用乙醚（5ml×3）提取，蒸除溶剂后与滤饼合并。真空干燥得浅黄色固体4.5g, 收率为58.80，mp 180.5-180.6，TLC（Rf=0.52 : 石油醚/乙酸乙酯= 2/1）, 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) : 3.72 (2H, t, -CH2Br), 3.87 (3H, s, -OCH3), 4.41 (2H, t, -OCH2- ), 6.88-8.26 (8H, -Ar); 13

17、C-NMR (CDCl3, 125MHz): 28.4, 55.4, 68.2, 101.1, 114.0, 114.6, 118.9, 124.1, 124.9, 128.1, 130.1, 152.1, 157.8, 159.6, 162.3, 175.8。 3.3 7-溴丙氧基 -4-甲氧基异黄酮(5b)的合成    将7-羟基-4-甲氧基异黄酮5.5g（0.02 mol）,无水 K2CO3 5.6 g 和1,3-二溴丙烷20.2 ml(0.20mol)加入到50 ml的DMF与200 ml的丙酮混合液中，60加热回流反应24h (TLC跟踪反应进程).反应完成后，冷

18、却至室温，减压过滤。滤液经减压蒸除丙酮和1,2-二溴乙烷至浓缩液，过滤，滤饼用水和少量乙醇洗涤后收集，滤液用乙醚（5 ml×3）提取，除去溶剂后与滤饼合并。真空干燥得浅黄色固体3.9 g, 收率为47.03，mp 248.5-249.1, TLC（Rf=0.56 :石油醚/乙酸乙酯= 2/1）, (CDCl3, 500 MHz) : 2.40 (2H , t ,-CH2-CH2-CH2) , 3.65 ( 2H, t , -O-CH2-) , 3.86 ( 3H , s , -O-CH3 ),4.23 (2H , t , -CH2-Br), 6.88-8

19、.24 (8H , m , Ar). 13C-NMR (CDCl3, 125MHz): 29.6, 32.0, 55.4, 66.0, 100.8,114.0, 114.7, 118.6, 124.2, 124.9, 127.9, 130.1, 152.1, 157.9, 159.6, 163.0,175.8。3.4 7-（2-硝基氧基）乙氧基-4-甲氧基异黄酮（6a）的合成 将硝酸银6.0g（0.035 mol）溶于无水乙睛20 ml中（避光），加热搅拌至50，迅速加入7-溴乙氧基-4-甲氧基异黄酮2.4 g（ 0.0064 mol）和无水乙睛55 ml的混合液。加毕继续加热至70

20、，反应2h(TLC跟踪反应进程)。过滤除去生成的氯化银沉淀，滤液浓缩得黄色黏稠状液体。向此浓缩液中加入乙酸乙酯和水，分出有机层，用乙酸乙酯（20 ml×3）萃取水层。合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，冷却并凉干，得到白色结晶1.4g, 收率为58.70 ，m.p.139.0-142.7, TLC（Rf=0.41; 石油醚/乙酸乙酯= 2/1）, IR (KBr) : 3445, 2927, 1633, 1517, 1446, 1297, 1259, 1025, 828; 1H-NMR(CDCl3, 500 MHz) : 3.86 (3H , s , -O-CH3 ),

21、4.36(2H , t , -CH2-ONO2), 4.89(2H , t , -O-CH2-), 6.86-8.25(8H, m, Ar). 13C-NMR (CDCl3, 125MHz): 28.3, 55.4, 64.5, 68.8, 70.4, 101.1, 114.0, 114.4, 114.6,119.1, 124.1, 125.0, 128.1, 128.2, 130.1, 152.1, 157.7,159.7, 162.1, 157.7;159.7, 162.1, 175.7 ; MS m/z+ 357.9。3.5 7-（3-硝基氧基）丙氧基-4-甲氧基异黄酮（6b）的合成&#

22、160;         将硝酸银6.0g（0.035 mol）溶于无水乙睛20 ml中，避光加热搅拌至50，迅速加入7-溴丙氧基-4-甲氧基异黄酮2.4 g（ 0.0062 mol）和无水乙睛55ml的混合液。加毕继续加热至70，反应2 h(TLC跟踪反应进程)。过滤除去生成的氯化银沉淀，滤液浓缩得黄色黏稠状液体。向此浓缩液中加入乙酸乙酯和水，分出有机层，用乙酸乙酯（20 ml×3）萃取水层。合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，冷却并凉干，得到白色结晶1.5g, 收率为65.53， m.p. 121.2-121.5, T

23、LC（Rf=0.42  石油醚/乙酸乙酯 = 2/1）, IR (KBr) : 3451, 2926, 1627, 1514, 1444, 1279, 1259, 1180, 1034, 888, 829; 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): 2.31 (2H, t, -CH2-CH2-CH2), 3.87 (3H, s, -O-CH3), 4.12 (2H , t , -CH2-ONO2), 4.73 (2H , t , -O-CH2-), 6.87-8.25 (8H, m, Ar). 13C-NMR (CDCl3, 125MHz): 26.9， 29.7,

24、 55.4, 64.2, 69.6, 100,8,114.0, 114.6, 118.8, 124.2, 125.0, 128.0, 130.1, 152.1, 157.8, 159.6, 162.7, 175.8; MS m/z+ 371.9。4. 讨论  本实验采用“一锅法”制备7-羟基-4-甲氧基异黄酮，再经过与一氧化氮(No)供体片段连接合成目标产物（VI-1,VII-1）。在参考文献基础上，对合成路线，实验条件（如试剂的选择，用量，加入方式：反应的温度，加热的时间），后处理方法等作了适当的改变。结果表明，在现有条件下，这一新化学合成方法得到产物较纯，收率能够在50左右，而且

25、合成试剂易得，反应条件温和，不需分离反应的中间体，后处理相对简单，因此，有一定的实际应用价值。 影响本实验的结果的主要因素有：1.（III）是制备7-羟基-4-甲氧基异黄酮的关键之间产物，其制备反应是典型的Friedel-Craftes酰化反应，反映的温度，升温方式，时间，水分，催化剂，对此酰化反应有重要影响。反应温度过低，（T<60），反应的能量供给不够，转化速率慢；反应的温度过高（T>100），间苯二酚可大量转化为焦油。经参考文献和几次试验，作者采用较温和的反映条件，即以BF3Et2O为催化剂和溶剂，恒温80。结果表明。有利于酰化反应的顺利完成，收率明显提高（78.70）。 2

26、. 由化合物7-羟基-4-甲氧基异黄酮制备7-溴丙氧基 -4-甲氧基异黄酮的反应中，由于异黄酮类化合物为苯并二氢吡喃结构，在碱性条件下其羟基进攻异黄酮类化合物的2-C得到二酮类化合物，继而发生开环反应，加上1.3-二溴丙烷在强碱条件下易发生消除反应，而脱去一分子溴化氢生成烯类气体，给反应造成一定困难。作者最初采用较大量的无水K2CO3，KOH和以乙醇做溶剂，以期生成目标产物，但收率极低。而后有参考文献 方法，改用无水K2CO3和丙酮，收率依然较低（21.10），但有所提高。最后，总结以上预实验步骤结果，确定用无水K2CO3作催化剂，并以适量的有机碱性试剂和一定量的丙酮作溶剂，并改进反应后处理方

27、法。通过以上措施，有效地避免7-羟基-4-甲氧基异黄酮开环忽然二溴丙烷的大量消耗，明显提高收率（47.03），而且产物不经重结晶就可直接用于下步反应。可用类似的方法合成7-溴乙氧基-4-甲氧基异黄酮。综上所述，采用“一锅法”2制备异黄酮类化合物，并通过新的试剂和方法用于它们的合成，使一氧化氮(No)供体型异黄酮类化合物的制备方法实现较好的应用价值。5. 产物(5a),(5b),(6a),(6b)的结构表征谱图Fig 1 1H NMR Spectrum of (5a)Fig 2 13C NMR Spectrum of (5a) Fig 3 1H NMR Spectrum of (5b)Fig 4

28、 13C Spectrum of (5b)Fig 5 IR Spectrum of (6a )Fig 6 1H NMR Spectrum of (6a)Fig 7 13C NMR Spectrum of (6a)Fig 8 IR Spectrum of (6b )Fig 9 1H NMR Spectrum of (6b)Fig 10 13C NMR Spectrum of (6b)参考文献1 雷英杰,赵康.5-甲基-7-4-二羟基异黄酮水溶性衍生物的合成及其抗缺氧活 性.中国药物化学杂志,2003,13(5):264-266. 2 赵一凡,克仁.异黄酮合成的研究进展. 四川化工,2006,9(3):14-18.3 印南日,衣克寒,冯志彪.异黄酮合成的研究进展. 食品研究与开发,2003,24(6):55-57 4 于小凤,孙茂春,白雪洁 ,胡春,付守廷.NO 供体黄酮类化合物的合成及其生物活性研究. 中国药物化学杂志,2005,12(4):197-201.5 肖志艳,陈迪