三叶木通的组织培养和多倍体诱导

1、三叶木通的组织培养和多倍体诱导三叶木通 Akebia trifoliate Thunb. Koidz. 为木通 科木通属 藤本植物，全株均可入药，具有通经下乳、清热利尿等 成效，主要分布 于甘肃、贵州、河北、河南、山东等地 1 。三 叶木通果实具有兴旺的 胎座组织，味甜可口，具有独特的风味， 含有许多人体必需营养成分 2-3 ，是一种具有开发潜力的保健 水果，但存在果皮厚、种子多、可 食率低的问题。多倍体植株具 有生物产量增加、药用活性成分增加、抗 逆性增强、植株育性下 降、少籽或无籽等特点， 多倍体育种可成为三 叶木通遗传改进的 途径之一。植物离体诱导多倍体的方法已成功地在许 多植物中取 得

2、成功， 其中建立组培快繁体系是其必要环节。 本试验旨 在以三 叶木通幼嫩种子为外植体进行组织培养获得丛生芽， 再用秋水 仙 素对丛生芽进行处理， 以获得三叶木通多倍体材料， 为无籽三叶 木 通的研究奠定根底。1 材料与方法1.1 材料三叶木通果实采自贵州省贵阳市花溪区棉花关， 植株经贵州 大学 生命科学学院赵财副教授鉴定为木通科木通属植物三叶木 通。1.2 方法1.2.1 外植体处理 2021 年 8 月中旬摘取三叶木通幼嫩果实， 毛刷刷去外表尘土 f 洗洁精浸泡 7 minf 自来水冲洗 20 min f 超 净工作台中取出种子 - 无菌水清洗种子数次 - 滤纸吸干外表水 分f 75尤醇消毒

3、15 s f 0.1% HgCI2浸泡7 min f无菌水冲洗 3次。将消毒好的种子横切成半、沿背腹线纵切成半，以不切作对 照处理，然后分别接种到 MS 培养基添加蔗糖 30 g/L 、琼脂 7 g/L , pH 值 5.8? 6 . 0 ，下同中。每个处理接种20 个培养瓶，每瓶 4 粒种子。25 ± 2 C黑暗培养40 d，统计出苗情况。1.2.2 无菌苗诱导培养采用适宜的切种方式，将消毒好的种 子接种在含 6-BA 不同浓度 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L 的 MS 培养基中进行无菌苗诱导， 每个处理接种 10 个培养瓶，每 瓶放 5 粒种子。25

4、77; 2 C黑暗培养30 d后，统计6-BA不同 浓度处理下 出苗率出苗率 =萌发外植体数 /接种外植体数x 100% 。1.2.3 继代增殖培养以 MS 培养基为根本培养基，设置不同 激素组合的处理，共 8 种培养基见表 1 中 A1? A8 号培养基。将无 菌苗接种于这些培养基中，每种培养基接种 10 瓶，每瓶 3 个外植体。25 ± 2 C光照培养光照时间12 h/d，光照度1 000 Ix 45 d 统计增殖系数。表 1 继代增殖培养基编号培养基 A1MS+0mg/L 6-BA+0.0 mg/L NAAA2MS+0.0mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAAA3MS+1

5、.0mg/L 6-BA+0.0 mg/L NAAA4MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA A5MS+2.0 mg/L 6-BA+0.0 mg/L NAAA6MS+2.0mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAAA7MS+3.0mg/L 6-BA+0.0 mg/LNAA A8MS+3.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA秋水1.2.4 多倍体诱导将生长良好的幼嫩丛生芽接入抽滤灭菌的仙素溶液中， 摇床振荡培养。 试验采用 2 因素 3 水平 L9 32 正 交试验试验设计， 试验设计见表 2。摇床转速设定为 50 r/min ， 培养 温度设定为24 C,光照2

6、4 h/d，光照强度为1 000 lx。处理完毕后转接 于 MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA 的培养基中 培养。 培养条件同上。1.2.5 多倍体鉴定取出小丛生芽块，放入卡诺氏固定液无 水乙 醇：冰乙酸体积比 3 : 1 中， 0 C 固定 1 周后，将小丛 生芽块取出放 到载破片上，用镊子捣碎小丛生芽块，用改进'宝品红染色液染色 1? 2 min ，盖上盖破片后在光学显微镜 下观察， 拍照。根据染色体数确定加倍处理材料的倍性。2 结果与分析2.1 切种方式对种子出苗的影响从表 3 可知，沿背腹线纵切成半的种子出苗率最高325% ， 横切成半的次之，不切半的种

7、子出苗率最低 75% ；纵切成半 的种子 平均出苗天数最短 15 d ，不切半的种子平均出苗天数 最长 35 d o 说明纵切种子能加快种子出苗，其原因可能是纵切处理使种子的胚暴露于培养基中， 胚无种皮限制而得以直接从 培养基中吸收养分而快速 生长； 横切可能破坏了胚的完整性或没 有使胚完全暴露于培养基中而 对种子出苗没有太大影响。2.26-BA 浓度对种子出苗的影响消毒好的种子沿背腹线纵切成半，接种于培养基中，培养15 d 左右种子便开始萌发，继续培养 15 d 后无菌苗高度可达 2 cm 左右 图 1。由表 4 可知， MS 培养基添加 6-BA 后能提高种子 出苗率。 随着 6-BA 浓

8、度升高，种子出苗率呈先升高后下降的趋 势。当 6-BA 浓 度为 1.0 mg/L 时出苗率最高，为 60%2.3 继代增殖培养基筛选由表 5 可知，当培养基中不添加 6-BA 时， NAA 处理的无菌 苗增 殖系数均为 1; 当 6-BA 浓度一定时，添加 0.3 mg/L NAA 与 不添加 NAA 的相比，无菌苗增殖系数均有所提高； 当 NAA 浓度一 定，随着 6-BA 浓度升高，无菌苗增殖系数先上升后下降， 当 6-BA 浓 度为 2.0 mg/L 时无菌苗增殖系数最高 5.70 。无菌苗转接 到增殖培 养基中培养一段时间后其基部可分化出白色的不定芽图 2；对不定芽继代增殖后，能得到

9、数目众多的丛生芽，这 些丛生芽具有分化成完整植株的能力。 2.4 秋水仙素对 丛生芽多倍体诱导的影响秋水仙素浓度越低，丛生芽死亡率也越低表6。 0.1% 的 秋水仙素处理下的丛生芽死亡率低， 0.5% 的秋水仙素处理过的丛 生芽死亡率最高。 0.1% 的秋水仙素处理的丛生芽虽然有较低的死 亡率， 但并未得到加倍的丛生芽； 0.5% 的秋水仙素处理过的丛生 芽得到了 2 块加倍的丛生芽； 0.3% 的秋水仙素处理丛生芽后得到 加倍的丛生芽块 数最多，其中以处理 24 h 的效果较好，诱导率 为 12% 。同一浓度的 秋水仙素在不同时间处理下多倍体诱导率并 未呈现常见的先上升后下 降趋势， 其原因

10、可能是高浓度的秋水仙 素对丛生芽的伤害大， 使得存 活下来的丛生芽数减少， 并且生活 力下降，从而使检测到加倍的丛生芽块数相应很少。2.5 多倍体鉴定 对三叶木通正常的根尖和丛生芽进行染色体计数， 得出正常 的三 叶木通染色体数 2n=2x=16 ，为二倍体图 3, 这与熊大胜 等得出的结 果 4 一致。成功加倍成多倍体的丛生芽染色体数为 2n=4x=32 ，为四 倍体图 4。这说明用秋水仙素诱导三叶木通获得多倍体的方法是有效的。3 结论与讨论沈国林等以三叶木通叶片、 茎段为外植体进行愈伤组织的诱 导， 但污染率高 5 。本试验选用三叶木通幼嫩种子为外植体， 建立三叶木 通组织培养体系。 选用

11、幼嫩种子为外植体具有材料多1 个果实约有种子 150? 200 粒、污染率低幼嫩种子在果 实里处 于一种相对无菌的环境等优势。继代增殖培养是组织培养的关键， 筛选适宜的增殖培养基才 能达 到离体快繁目的 6 。在无菌苗的继代增殖过程中， 6-BA 和 NAA 组 合是常用的激素组合 7-8 。在三叶木通无菌苗继代增殖 培养中发现，单 独使用 NAA 不能使无菌苗增殖，单独使用 6-BA 可以使无菌苗增殖， 附加 NAA 后增殖系数提高，说明 6-BA 在三 叶木通继代增殖培养中起 主导作用。丛生芽结构完整、 材料幼嫩， 可直接形成小植株， 而且成苗 率高， 经化学诱变剂诱导处理后，易于获得纯的

12、多倍体植株，所 以本试验采用 了丛生芽作为诱导材料。 秋水仙素是常用的化学诱 变剂，通过抑制纺 锤体微管的形成而导致染色体不能移向细胞两 极从而产生多倍体。 秋 水仙素对不同的植物和植物不同部位的诱 导所需要的浓度和处理时间 不同。 三叶木通为木质藤本， 对秋水 仙素处理的浓度要求较高，在本 试验中表达在 0.1%的秋水仙素 处理丛生芽 24、 48、 72 h 均未检测 到多倍体细胞。虽然较高浓 度秋水仙素处理过的丛生芽存活率小，但凭 借其快速增殖的优 势，能获得大量的加倍的丛生芽。三叶木通多倍体的研究国内仅见熊大胜等用秋水仙素处理 种子和 幼苗的报道 9-10 。熊大胜等对加倍诱导的材料只进行了 生理学和形 态学鉴定。目前流式细胞仪能用于鉴定植株的倍性 11-12 ，使得常规 诱导多倍体方法有了可靠的鉴定方法。但组 培技术和化学诱导相结合的 离体培养诱导法已成为一种最常用 的染色体加倍方法。离体培养诱导法 与常规的诱变育种方法相 比，具有明显的优越性。 首先在组织培养条 件下可以反复大批量 地