凝胶层析法测蛋白质分子量

1、蛋白质分子量的测定一一凝胶层析法实验目的1. 了解凝胶层析的原理及其应用。2. 通过测量蛋白质分子质量，初步掌握凝胶层析技术。3. 了解洗脱曲线、选择曲线的意义，并学会绘制洗脱曲线、选择曲线。二、实验原理(-)蛋白质分子量的测定蛋白质是生命过程中最重要的物质之一，近年来已成为生命科学领域的研 究热点 。分子量是蛋白质的主要特征参数之一，当发现一种新的蛋白质时，首先应准确测 定其分子量。蛋白质分子量的测定方法有多种，如渗透压法、光散射法、超速离心 法、凝胶层析法及聚丙烯酰胺凝胶电泳等P3。(-) 凝胶层析法层析法，又称色层分析法或色谱法(Chromatography)，在1903.1906年由俄

2、国 植物学家M.Tswett首先提出。虽然近年来质谱技术日益成熟,灵敏度、精确度也为各 种方法之首，但是目前在实验室中测量蛋白质分子量应用比较广泛的还是凝胶层析等 方法。凝胶层析法(gel filtration )，又叫凝胶过滤法、凝胶渗透色谱法 (GPC )、排阻色谱法、凝胶过滤色谱法(GFC)、分子筛层析法(molecular sieve chromatography )等，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，如同过筛可以把大颗 粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜的溶 剂中浸泡，使充分吸液膨

3、胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶 剂洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝 胶颗粒间的空隙最先流出柱 外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子 大小不同的物质得到分离。由于其分离条件温和、样品回收率高、实验的重复性高、设备简便经济等特 点，是目前最广泛使用的生化物质的分离方法之一，是所有色谱技术中最简单、条件 最温和的方法，且完全是基于样品的分子量大小来进行分离的。虽然其分离效果不及高效液相色谱，但可作为一种初步的分离手段使下一步的纯化达到更好的效果。 (三)凝胶凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，其内部具有很微细的多孔 网状结构

4、。常 用的天然凝胶是琼脂糖凝胶(agarose gel，商品名Sepharose)，人工合成凝胶是葡聚糖(dextran，商品名为SePhadex)，凝胶型号不同，孔隙度不同，但都不溶于水。这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量 级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分 离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分 离不同分子量的物质。(四)测量方法凝胶过滤层析，是一种分离不同大小分子的分配层析，被分离物质的分子在溶剂和限定孔径的凝胶固定相中被分配，混合物随流动相流经层析柱时，各种物质同时进行着垂直

5、向下的运动和无定向的扩散运动，混合物中各 物质因相对分子质量的大小不同而被分离，这种方法操作简便，费用较低，重复性好。因其能像筛子一样筛分不同大小的分子，因此又称 为“分子筛”。其具有许多良好的性能，因此在蛋白质的分离分析中被广泛采用。经 过不少人的实际应用和完善，该方法已经变成一种可靠的测定高分子分子量的方法9 o将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt ( total volume )表示。Vt由三部分组成，即 Vt=Vo+Vi+Vg。V。称为“孔隙体积”或“外 体积” (outervolume )又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间 的水相体积，相当于一般层析法中柱内

6、流动相的体积；Vi为内体积(innervolume )，又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相 当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；Vg为凝胶本身的体积。而洗脱体积(Ve , elution Volume )与V。及Vi之间的关系为：Ve=Vo+Kd - ViVe是自加入样品时起，到组分最大浓度(峰)出现时所流出的体积；本实验凝胶层析柱 中填充的是交联葡聚糖，含有蛋白的溶液通过管柱时，大分子的蛋白呈正态分布连续 首先流出，会形成一个蛋白峰o Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数，只与被分离物质

7、分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有 关，而与柱的长短粗细无关。Kd可通过实验求得：Kd= ( Ve- Vo ) /Vi上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液(带颜色为佳，便于观察，如血红蛋白、印度黑墨水等，分子量约200万的 蓝色葡聚糖2000等)通过实际测量求出；Vi可由gWR求得(g为干凝胶重，单位 为克；WR为凝胶的“吸水量”，以毫升/克表示)。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实验得知某一物质的洗脱体积 Ve,就可算出它的Kd值。三、实验器材1 试剂(1) 标准蛋白质：蓝色葡聚糖-2000 ( 200KD)，牛血清清蛋白(67KD),胰凝乳蛋白酶原(

8、24.5KD )，CytC ( 13.7KD )，均为分析纯。(2)洗脱液：0.2mol/LTHsHCIKCI,pH7.5取 0.5M KCI 20ml,0.2M Tris 25ml,0.1 M HCI40.3ml,再加 违 0 定容至 100ml(3) Sephadex G-752. 器材(1)层析柱：柱管1.2x50cm(2 )紫外分光光度计(3)部分收集器(4) 刻度试管四、实验步骤1 .凝胶的选择与处理：本实验使用Sephadex G-75凝胶。商品凝胶一般是干燥的颗粒，使用前需在 欲使用的洗脱液中充分溶胀。即在沸水 浴中，将悬浮于洗脱液中的凝胶浆逐渐升温 至近沸，一般12h即可完成。

9、根据层析柱的体积和所选用的凝胶，膨胀后床体积计算所需凝胶干粉的重 量，然后倾入过量的洗脱液中，室温吸水膨胀。凝胶颗粒最好大小均匀，这样流速 稳定，结果较好。2 .装柱：本实验所用层析柱的规格为1.2 x 50cm。(1)将层析柱垂直装好，在柱内先注入1/41/5的水，出口处接上一 根长约1.5m，直径2 mm细塑管，塑管另一端固定在柱的上端约45 cm处。然后打开机器，排出气泡。(2)随着下面水的流出，上面不断加凝胶，使形成的凝胶床面上有凝胶的连续下 降。(3)当凝胶沉积到柱的顶端约6 cm处，可停止装柱。(4)用眼睛观察柱内凝胶是否均匀，有否“纹路”或气泡。若层析柱不均一，必 须重新装柱。3

10、 .加样：加样之前先吸去柱管内的上清液，然后加样。等到所加的样与凝胶界 面相平时，连接恒压瓶、层析柱、部分收集器等装置。4 .洗脱：待上述工作做好之后，开始洗脱。洗脱时应严格控制流速，以3 4分钟收集3ml液体为宜。然后用部分收集器按每管3mL收集洗脱流出液，各收集管于280nm处检测A280值。5 .洗脱曲线、标准曲线的制定(1)按上述步骤依次加入蓝色葡聚糖-2000 ( 200KD)、牛血清清蛋白(67KD)、胰凝乳蛋白酶原(24.5KD )和CytC (13.7KD )，然后用50 mmol/l的KH2PO4-K2Hpe>4缓冲液溶液洗脱。待上一个样品在管柱中行进约1/3时再加下

11、一个样。用部分收集器收集流出液体，然后用紫外分光光度计于280nm处测定每 管A值，以管号或者洗脱体积为横坐标，A值为纵坐标绘出洗脱曲线。根据洗脱峰位置量出每种蛋白质的洗脱体积Ve。然后以蛋白质分子量的对数(1gM)为横坐标，Ve为纵坐标，作出标准曲线。为了结果可 靠，应以同样条件重复1.2次，取Ve的平均值作图。五、实验结果1 .洗脱曲线：本实验共依次加入4种分子量已知的蛋白质，分别为A:蓝色葡聚糖-2000 ( 200KD)、B:牛血清清蛋白(67KD)、C:胰凝乳蛋白酶原(24.5KD、和 D:CytC (13.7KD )。每3 4分钟收集3ml液体为一管，共收集了25管，每管在280n

12、m处测得的吸光度值A值(即OD值)见表1 :表1：每管洗脱液对应的OD值管号12345ODfi0.020.0370.0410.3180.14管号678910ODfi0.0360.0060.3260.0890.053管号1112131415ODfi0.0190.0240.060.2860.344管号1617181920ODfi0.220.0780.0310.0240.105管号2122232425ODfi0.1840.1340.0910.0470.023因此，以管号为横坐标， OD值为纵坐标绘制的洗脱曲线见图 1 :由表1算得4种样品的洗脱体积分别为：Ve (A:蓝色葡聚糖)=(3+0.5) X

13、 3=10.5mlVe(B:牛血清清蛋白)=(8-3-0.5) x3=13.5mlVe (C:胰凝乳蛋白酶原)=(15-7-0.5) x 3=22.5mlVe (D:CytC) = (21-11-0.5) x 3=28.5ml2.标准曲线：以蛋白质分子量的对数(1gM)为横坐标，Ve为纵坐标,作出标准曲线表2:各样品洗脱体积和IgM值样品MIgMVeA2000005.30110.5B670004.82613.5C245004.35122.5D137003.87628.50D值图1洗脱曲线图1 :加入的4种分子量已知的蛋白质的洗脱曲线，由上图可 知：分别在第4、8、15和21管时出现峰值。图2标

14、准曲线图图2:加入的4种分子量已知的蛋白质的标准曲线-线性（辰）六、分析讨论蛋白质是生命过程中最重要的物质之一，早已成为生命科学领域的研究热 点。而分子量是蛋白质的主要特征参数之一，故准确测定其分子量意义重大。凝胶层析法在蛋白质分子量的测定方面，虽然不及聚丙烯酰氨凝胶电泳的灵敏度及准确度高，但因其操作简便、试剂价格较为便宜等优势而受到人们欢迎。影响分子量测定准确性的因素众多，有一定的局限性。如缓冲液的pH值、凝胶的型号、加样时间间隔、顺序，以及收集洗脱液的操作等等都会对实验结果产生影响。缓冲液的pH值在6-8时，所得的标准曲线的线性较为良好，本实验所用的缓冲液的pH值为7.5，在该范围之内，故

15、在其他操作良好的情况下所得的线性较为良好。凝胶的型号对分离的准确性产生影响。比如Sephadex G-100和Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱，前者可在前期去除相对分子质量较大的杂蛋白，而后者的分离范围只有1000-30000。我们的目标蛋白相对分子质量在 10000-200000 左右，故用 Sephadex G-100 或者 Sephadex G-75 可得到较好的分辨率。加样时间间隔、顺序对结果准确性的影响。本实验采取加入单一样品的方法， 按分子量由大到小加入，并且待上一个样品基本上快要走出柱管时才加下一个样。 分子量大的样品不能进入凝胶内部，在凝胶颗粒 之间的缝隙流出，因此速度最

16、快。 从大到小加样，可以保证前一个样品基本上被分离出来，确保了会出现峰值，能得出较为准确的洗脱体积。分光光度计使用波长为280nm时，是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，260rlm是核酸最高吸收峰的吸收波长。故本实验测定蛋白质 的分子量使用 280nm 。七、注意事项1.加样时按分子量由大到小加入，以便于出现峰值和计算洗脱体积。2,洗脱液的pH值应在6-8得范围内，以保证标准曲线的良好线性。3 .加样之前应赶出管柱内的气泡，并在整个操作过程中都要保证不产生 气泡，否则 洗脱速度很慢并且结果也不准确。4 .收集洗脱液的速度应严格控制在每3 4分钟收集一管液体(约3m)。5 .分光光度计使用波

17、长为280nm。6 .实验结束，及时清洗整理实验用品，经指导老师同意后才能离开实验室。参考文献：1石磊，季怡萍，蛋白质分子量测定过程中的酸效应J.分析化学，2002 (8) ： 9389412孔毅，吴梧桐，吴如金，蛋白质分子量测定方法比较研究J.分析仪器，2003 (2)：44 463王雅，蛋白质测定实验的研究网实验室研究与探索,20(4):58-594王玉贤，相玉红，强洪，仪器法测定蛋白质的实验研究J.实验技术与管理2006:31 32(5) Fenn JB,Mann M, Meng CK, Wong SF,Whitehouse CM ， Electrospray ionization formass spectrometry of large biomoleculesJ. Scienee, 1 989,246( 4926)： 6471黄明智，明胶化学基础讲座一一凝胶层析法J.明胶科学与技术7982 (3)： 148- 154J.食品工业科7于志鹏，赵文竹，