细菌RpoN蛋白的发现及功能初探

1、细菌RpoN蛋白的发现及功能初探细菌RpoN蛋白的发现及功能初探本文关键词：初探，细菌，蛋 白，功能，发现细菌RpoN蛋白的发现及功能初探本文简介：摘要：RpoN蛋白 是RNA聚合酶的一种。因子，随着近年来对于RpoN基因功能的探索, 其多种功能被发现，如胁迫应答、调控措施氮源及碳源的利用、调控 细菌防护力及毒力等。本文对不同种属细菌中RpoN基因的功能成功进 行整理，力图为深入研究不同细菌RpoN蛋白介面奠定基础。关键词：RpoN蛋白；转细菌RpoN蛋白的发现及功能初探本文内容：摘 要：RpoN蛋白是RNA聚合酶的一种。因子，随着近年 来对于RpoN基因功能的探索，其多种功能被发现，如胁迫应

2、答、调控 措施氮源及碳源的利用、调控细菌运动性及毒力等。本文对相异种属 细菌中RpoN基因的特性进行整理，旨在为深入研究不同细菌RpoX受 体功能奠定基础。关键词：RpoN蛋白；转录；表达调控；Abstract： RpoN protein is a sigma factor of RNA polymerase. In recent years, many functions were found with the exploration ofrpoN gene faction.Such as forced response, regulate and control the use of ni

3、trogen source and carbon source, regulation of bacterial motility and virulence. In this paper, to organize the function of RpoN genes in different species of bacteria. It's aims to lay a foundation for further study of the function of different bacterial RpoN proteins and control of bacterial d

4、iseases.Keyword： RpoN protein; Transcription; Express regulation;RpoN是。家族的唯一成员，最早在肺炎克雷伯氏菌中克隆得 到，随后在固氮菌、根瘤菌、红细菌以及假单胞菌中也克隆到了类似 序列，起初的研究认为RpoN仅仅与氮排泄相关，但后续的研究表明其 还与逆迫应答、碳源的利用、运动及毒力等基因表达相关。近年来有 关RpoN的研究报道急速增多，它能够调控多个功能基因的转录与表达, 在很多许多细菌中发挥至关重要的作用。1、。因子简介转录是生物合成的必要步骤，由多种蛋白共同作用，RNA聚合 酶是该过程的重要蛋白，多肽全酶包括核心酶(a2

5、B (T )和。因子 两大部分，大多数。因子是一类相对较小的蛋白家族，它们通过可逆 地与聚合酶的核心酶结合并参与积极参与识别启动子。在转录的过程 中，。因子作为一种多肽不与DNA结合，RNA聚合酶全酶与启动子结 合时可产生较牢固的激酶，在的位置又可转变为较疏松的复合物。当 全酶与。因子分开后，核心酶沿着DNA链移动进行延伸，以此进行转 录。原核生物可通过。因子选择性的与启动子结合从而进行自身。根 据数组的功能相似程度以及功能的差异，可将。家族分为。70 (RpoD、 RpoS、RpoH等)和。54 (RpoN)家族，。70在一般细菌中主要负责 管家基因的调控；。54 (RpoN)控制一套多元化

6、全套基因的转录，能 调控很多不同基因的转录与表达。且不同。因子之间存在共振。RpoN是。54家族中唯一的领导者，在不同细菌中具有相似性。 基于序列相似性的特点可将其分为3个区域：区域1由25-50个氨基 酸构成a 2螺旋，富含Leu和Gin；区域2为可变区域，包含60-110 个氨基酸序列，多数为酸性氨基酸残基；区域3是序列的梭基端，大约含有400个残基，这个区域又包含三种典型的构象X-LIXK构象、HTH构象和完全保守区的RpoXBOX （含有10个保守的氨基酸侧链）1K2、RpoN的发现及功能初探对于RpoN的研究最早见于1985年，Merrick和Gibbins在肺 炎克雷伯氏菌中克隆到

7、rpoN基因。随后，在固氮菌、根瘤菌、红细菌 以及假单胞菌中也克隆到了类似序列。起初的研究认为RpoN仅仅与氮 代谢相关，但先期的研究表明RpoN可调控多种生物学特性。2. 1、RpoN在氮源调控措施的研究自rpoN基因首次正式进入学者的视线中，其在氮新陈代谢代 谢的功能最早被发现。一般来说，细菌中的氮循环过氧化氢都需要经 过氨氧化、同化以及硝化的整个过程，当形成NH4+才能可以参与细菌 的生命活动，供菌体利用。研究报道，RpoN的缺失会导致细菌对缺位 氮源利用能力的减弱甚至丧失。对大肠杆菌中rpoN基因进行敲除，缺 失株与野生株相比较，NH4cl利用能力明显下降；而丁香假单胞菌 rpoN缺失

8、株则无法利用氮源生长，同样的结果也出现在绿脓杆菌的 rpoN缺失株的研究中2 o2. 2、RpoN在碳源调控措施的研究对RpoN的研究最初见于细菌氮源同化上，但随着研究深入发 现它在碳源调控中也扮演重要角色。在恶臭假单胞菌中，由于其生活 情形较为复杂，有数种可被利用的碳源，当rpoN被缺失，其虽然可以 在以为唯一碳源的培养基上正常生长，竟却不能在以苯乙酸为唯一碳 源的培养基中生长，而野生菌株却可以在两种碳源中均可生长，其通 过RT-PCR分析发现乙酸乙酯通透性酶编码基因paal无法在rpoN缺失 株中表达，产生所谓消除的碳代谢抑制现象。除了直接排泄调控某些 碳代谢途径的关键酶外，RpoN不但通

9、过调控非编码RNA参与多种碳源 的利用过程：丁香假消息单胞菌中存在CrcX参与碳调控过程；在绿脓 杆菌中，还存在一个双组分系统CbrAB与RpoN共同调控crcZ、crcY 的表达量从而影响碳代谢过程，绿脓杆菌rpoN缺失株中crcZ和crcY 表达量下降5。进一步研究发现缺少在其缺失株中仍能检测到crcZ. crcY的转录产物，只是五个这两个基因的转录受到RpoN的影响。2.3、 调节真菌运动能力2.3、 、1参与细菌的刚毛合成过程运动是细菌趋化以及定殖的关键，细菌的重要运动器官是微 生物鞭毛，不同菌株的鞭毛合成演化过程每种类似，但其调控机制却 虽然存在很大差别。研究表明RpoN与细菌鞭毛的

10、形成以及调控细菌的 定殖存在一定关联。据报道，在绿脓杆菌中，rpoN的缺失导致其对上 皮细胞的粘附力下降，通过电镜观察菌体完全丧失鞭毛结构；在迟钝 爱德华氏菌中，RpoN的缺失也显着影响细菌的运动能力；在研究大肠 杆菌rpoN也能发现与棒状的合成相关，控制着菌体的运动性，但并未 发现rpoN识别保守结合位点，推测rpoX通过FlhDC间接调控鞭毛调 节因子fliA的表达，或者rpoN与FliA共同调控鞭毛基因的转录和表 达；通过透射电镜观察斯氏假单胞菌A1501rpoX缺失株发现缺失株无 鞭毛，又通过趋化观察到该菌株丧失运动能力；由芯片技术寻获绿脓 杆菌rpoN缺失株中50个鞭毛基因中有43个

11、基因的表达量发生较为明 显变化。由此可见，RpoN在鞭毛基因的表达核酸调控中扮演重要角色。2.4、 2、参与菌毛合成投资过程细菌的菌毛属性有：P菌毛、I型菌毛、IV菌毛等等，它与细 菌的黏附、运动以及致病性密切相关。Ramphal等研究发现绿脓杆菌菌 毛合成受到RpoN的调控，同时RpoX的缺失导致其细胞壁黏附能力显 着下降3；在长奈瑟球菌以及假单胞菌Rpo缺失株中均能菌毛的合 成及运动也会显着下降4。后续研究发现，很多噬菌体阴性菌RpoN 对菌毛合成过程的制约主要源于PilA的调控，PilA受RpoN和PilR- pilS共同调控，PilS接受旁人信号刺激后自身发生磷酸化，随后磷酸 化Pil

12、R,磷酸化的PilR与RpoN共同激活PilA转录起始5,随后 PilA通过翻译、组装、呈现出菌毛的基础结构。2.4、 调控生物被膜合成及毒力相关细菌的胞外多糖被认为与该细菌毒力、生物被膜合成技能及 耐药性有很大关系。相关研究表明，在迟钝爱德华菌中所rpoN缺失能 导致生物被膜形成能力下降；在固氮施氏假单胞菌中rpoN的缺失却导 致生物被膜形成本领丧失；但在鼠伤寒沙门氏菌中，rpoN缺失株却导 致生物被膜形成能力增强，使细菌在不利条件下产生胞外聚合物黏附 在电磁辐射表面，以固着的方式逐步形成生物被膜，以便适应不利环 境。所以说RpoN是非常重要的压力调控因子，这一发现为进一步研究 RpoN调控

13、生物被膜己经形成机制奠定了基础。细菌生物被膜存在于非 生物或生物表面，一直被认为与病原菌毒力密切相关，其可以为病原 菌抵抗不同的环境压力、避免防空免疫系统清除以及来自宿主的各种 化学防御6, 7,因此对于细菌被膜的研究从某种意义上就是之上对其 毒力的研究。3、RpoN蛋白表达调控的研究3. 1、RpoN蛋白调控其他。因子表达在革兰氏噬菌体中，。因子之间相互的级联调控关系控制着 连续的基因表达；而在革兰氏阴性菌中所，。因子控制着离散基因簇 的表达8。因子之间的相互作用使得不同的间压力信号得以扩充从 而产生相互协调的基因应答。有试验证实RpoN与RpoS之间存在拮抗 作用，双缺失后在许多菌体中产生

14、形成了相反的效应：结果显示比如 迟钝爱德华氏菌中其基因芯片结果显示RpoN调节子中60%受RpoS调控, RpoN的缺失对RpoS的表达具有正调控；。70家族蛋白FliA受RpoN 的正调控；在大肠杆菌中。因子之间复杂的限于调控关系涉及到菌体 运动性、氮源利用、压力调控措施以及其他细胞功能9。试验发现。 因子的相互作用是依赖于。因子之间的糖分相对含量以及它们对RXA 聚合酶核心酶的亲和力。除此之外，相关研究表明，在鼠伤寒沙门氏 菌中rpoN、rpoE rpoH rpoS、rpoD等。因子在指数期和生物被膜 形成期的基因表达有差异10 o3.2、 控制rpoN转录的因子RpoN作为一个。因子，是

15、细菌转录主要水平调控网络的一个 重要组分，控制转录的因子主要有以下几种：3.2.1、 c-di-GMPc-di-GMP是细菌体内普遍存在的第二信使分子，它能够激活 级联系统中蛋白的活性，它可以瞬间升高、且能快速降低，并由此调 节细胞内代谢系统的酶活性，控制细胞的肉体活动,包括:葡萄糖的摄 取量和利用、脂肪脂质的储存和移动以及肝细胞产物的分泌。第二信 使也控制着细胞的增殖、分化和生存，并参与基因转录的调节。相关研 究表明，高浓度c-di-GMP调节生物膜的产生，低浓度c-di-GMP抑制 生物膜的产生。c-di-GMP控制生物膜胞外多糖编码的固相产生，通过 Bcaml330-Bcaml341基因

16、推动细菌蛋白的强化。GMP与增强子结合调节 生物膜胞外多糖的稳定并激活RpoN依赖的转录调节因子。c-di-GMP 作用的核开关是核最老发现的不参与代谢活动而参与信号传导的目前 开关，其发现有利于解释c-di-GMP生物学功能的多样性。Fazli等研 究表明在洋葱伯克霍尔德氏菌中rpoN专业知识的缺失株无生物膜合成 能力，通过激活编码c-di-GMP后发现胞外多糖合成基因可在其中进行 表达，因此可推测是c-di-GMP是RpoN的转录调节因子。但是对c-di- GMP的确切调控措施机制目前现今仍不十分清楚，还有待更深入的研 究11。3. 2. 2、RpoN的启动子对转录的影响启动子为转录的起始

17、位点上游邻近的功能区。RpoN启动子的 保守区分布在起始位点上游的T2和-24位置。很多细菌的转录即使依 赖于RpoN启动子，从而控制许多生物学特质，如趋化性或运动性12。 在大肠杆菌中，有接近100个rpoN分子，但真正为rpoN依赖型启动 子的数量却不到20个；在铁还原菌中，受到RpoN负调控的基因(如 fliL、fdnG、nifEN)启动子区结合位点相对受正调控的基因(glnB> , dcuB)的位点更加保守，这些序列上才的差异可能导致RpoN对不同基 因的调控差异；还有实验向非典型RpoN依赖型启动子中核糖体人为引 入保守结合元件，可导致RpoN与启动子结合能力增强。同时-12区

18、的GC含量变化也会导致潜能转录的能力的尽失。RpoN启动子参与调控多 种代谢过程，苯甲酸和二甲苯的降解、二竣酸的输送、菌毛蛋白的合 成、氮固定、氢摄取、鞭毛组装、精氨酸分解、藻蛋白酸盐生成、鼠 李糖脂生成、乙偶姻分解甘露糖摄取和肺氨酸亚氨基肽酶激活13。 因此，启动子对于RpoN的甲基化存在至关重要的尤为重要影响。3. 2. 3、EBPsRpoN的转录需要某些特定激活蛋白(enhance binding proteins)的参与，他们发生改变转录起始复合物构象来与转录复合 物通过作用。激活蛋白结合在UAS区，并在宿主因子帮助下让在UAS 区与启动子之间插入一个回折。激活蛋白上。54-RXAP重

19、要一环酶结 构域具有能水解ATP的腺甘酸七磷酸酶的活性14。增强蛋白属于双 组分调节，当细菌处于低浓度氮源前会，组氨酸激活酶NtrB促使NtrC 磷酸化，从而结合到UAS区激活转录；高浓度氮源时，磷酸化的NtrC 减少，非磷酸化的NtrC虽然会结合到UAS区，却无法失活转录的功能。 在致病性钩端螺旋体当中，通过对RpoN的激活蛋白FhlA的研究中发 现，fhlA缺失株中LA1188、LA1968、amtB三个氮代谢相关基因的表达 量均下调，推测其通过FhlA-RpoN信号通路从而影响转录。所以，激 活蛋白对RpoN的转录是必不可少的。4、结语与展望目前，在很多菌种中对RpoN甚至有一定的的研究

20、。RpoN缺失 细菌在一些有所不同的环境压力下存活能力减弱，如酸碱性环境、高 渗环境、饥饿条件、氧化耐受条件下条件生还能力改变，表明RpoN是 重要的压力调控因子同时还调控氮源以及碳源的，对鞭毛非常大以及 生物被膜的合成也存在一定的关联，细菌对于基因的转录调控并不是 简单的单一通路，细菌必须通过各种信号通路确保基因的表达，以调 适不同的环境，其中RpoN就是典型的调控遗传，RpoN作为一个。因 子，是细菌转录水平调控技术水准网络的一个重要组分，RpoN转录组 水平的研究，对于调控细菌的研究机制来说，具有积极意义。近几年由于环境的破坏以及抗生素的滥用，使得在养殖业中 所更为对细菌的病害防治越来越

21、难。RpoN调控多种基因，由于Rpo的 缺失也能导致细菌致病能力的下降，因此RpoN的研究为细菌防治提供 新的策略。家族调控的基因数量是非常大的，其次不同家族成员的 多缺失情况下也会产生不同的结果。因子之间存在复杂的相互联系, 相互之间的作用机制还有待我们深入研究。另外，维氏气单胞菌广泛分布于自然环境中，溃疡动物感染 后症状多为急性腹泻、菌血症、脑膜炎、心内膜炎等，近年来，维氏 气单胞菌毒力逐渐增强，因此越来越多的研究人员开始对其兴趣。 RpoN在很多菌属中是一系列毒力、压力、运动上述的重要调控者。之 前关于维氏气铜绿单胞菌中未曾有过关于RpoN的报道(资料可查)， 因此构建其缺失株及其功能的

22、研究具有涵义重要意义。本实验室一直 致力于维氏气单胞菌的研究，实验团队积极构建该基因的缺失株及互 补株，为维氏气单胞菌RpoN功能研究奠定基础，同时，也为丰富不同 菌株RpoN性质提供数据的支持。参考文献：1 Merrick M J. In a class of its own 一 the RNA polymerase sigma factor。；54 (oN) J. Molecular Microbiology, 2021, 10(5) :903.2李耘.固氮施氏假放线菌RpoN过氧化氢蛋白调控硝酸盐 同化的促进作用机制D.中国农业科学院，2021.3 Gui lion A, Brea D,

23、 Morello E, et al. Pseudomonas aeruginosa Proteolytically Alters the Interleukin 22 dependent Lung Mucosal DefenseJ. Virulence, 2021:1.4 Thakur S D, Dillon J R. Suitability of a chocolate agar-based medium for the transportation and long term storage of Neisseria gonorrhoeae isolates at room tempera

24、ture. J. J Microbiol Methods, 2021:86-87.5 Filiatrault M J, Stodghill P V, Wilson J, et al.CrcZ and CrcX regulate carbon source utilization in Pseudomonas syringae pathovar tomato strain DC3000J. Rna Biology, 2021, 10(2):245-55.6J Pitts B, Hamilton M A, Zelver N, et al. A microtiter-plate screening

25、method for biofilm disinfection and removalJ. Journal of Microbiological Methods, 2021, 54(2) :269.7J Kumar C G, Anand S K. Significance of microbial biofilms in food industry: a reviewLJ. International Journal of Food Microbiology, 2021, 42 (12):9.8 Bang I S, Frye J G, McClelland M, et al. Alternative sigma factor interactions in Salmonella: sigma and sigma promote antioxidant defences by enhancing sigma levels. IJ. Molecular Microbiology, 2021, 56(3)：811-23.9 Prouty M G, Correa N E, Klose K E. The novel 。54?and 。 28?depen