细胞生物学研究方法-长沙医学院

1、长沙医学院教案 课程名称 细胞生物学 授课题目（章节或主题） 第三章细胞生物学研究方法 授课教师 黄秋霞 所属系（部） 基础医学 系 所属教研室 生物技术 职 称 助 教 授课时间 年 月 日第周 星期第节 第次课 授课时数 3 授课班级 生物技术专业（本科） 级 班 教学课型 理论课 教材名称、作者、出版社及出版时间 细胞生物学、 翟中和主编、高等教育出版社、 2007.8 教学目的要求： 重点与难点： 重点：理解与掌握一些基本的细胞生物学研究方法，并在此基础上能够使各种技术巧妙的结合。 难点：普通复式光学显微镜构造原理；荧光显微镜的构造原理；电子显微镜的基本构造；电子显微 镜与光学显微镜的

2、基本区别；原代细胞与传代细胞的概念。 教学方法（请打2选择） : 讲授法2讨论法启发式自学辅导法口 练习法（习题或操作）读书指导法 PBL（以问题 为中心的教学法）其他口 教学手段（请打2选择） : 板书2实物口标本口 挂图口模型口 投影2幻灯录像口 CAI （计算机辅助教学）2 教学过程设计和教学内容: 此列为提示栏 时 （包括重点、难 间 点、教学方法、 分 教学手段、更新 配 教学内容、教书 份 引入： 育人等） 钟） 细胞生物学的发展与技术的发展关系 显微镜一电子显微镜一分子生物学的方法 由细胞生物学的 简单列举细胞生物学研究的实验方法 发展史中电子显 细胞结构 细胞亚显微结构 细胞组

3、分 核酸、蛋白质等定位 微镜的地位引出 3 第三章 细胞生物学研究方法 细胞生物学研究 方法的重要性； 第一节细胞形态结构的观察方法 研究方法的基本 一、光学显微镜技术 分类 细胞的一般大小与人眼分辨率之间的关系引出显微镜的使用 10 （一）普通复式光学显微镜技术 光学显微镜技术 1、组成：照明系统 :光源、折光镜和聚光镜，有时附加滤光片控制光 的基本组成和原 的波长。光学放大系统：目镜和物镜组成。机械装置 理；分辨率的概 2、分辨率： 指分辨物体最小间隔的能力。 念（举例说明）； 光学显微镜的分辨力 R=0.61入/N . A. -其中入为入射光 线波长；N. A.为镜口率 sin a /2

4、 ； n=介质折射率；a =镜口角 （样 品对物镜镜口的张角） 。 3、 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像 4、 显微镜的几个光学特点： 介质折射率越接近镜头玻璃的（ 1. 7 ）越好。 sin a /2的取大值小于1;油镜介质为香柏油，镜口率可接近 1.5。 普通光线的波长为 400700nm,光镜分辨力约为 0.2卩m,人眼的分 辨力为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为 1000X。 光镜样本制作样品T 固定T包埋T切片T 染色（如伊红和美蓝 能与蛋白质结合；品红能与 DNA结合） （二） 相差和微分干涉显微镜技术 1、 基本原理： 相差显微镜： 把透过标本的可见光的光程差或

5、相位差转换成振幅差， 从而提咼了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见 微分干涉显微镜技术：利用两组平面偏振光的干涉，加强影像的明 暗效果，能显示结构的三维立体投影。 标本可略厚一点，折射率差别更大， 故影像的立体感更强。 2、 应用： 相差显微镜可用于观察活细胞。在构造上，相差显微镜有不冋于普 通光学显微镜两个特殊之处 微分干涉显微镜技术：偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区 别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较 大的细胞器 （三） 荧光显微镜技术 1、 基本原理：光源为短波光；有两个特殊的滤光片；照明方式通 常为落射式 2、 应用：观察能激发出荧光的结构。

6、用途：免疫荧光观察、基因 疋位、疾病诊断。直接荧光标记技术 （四） 激光扫描共聚焦显微技术 1、 基本原理：用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描 ，形成 立体图像，可重构样品的三维结构。分辨力是普通光学显微镜的 3 倍。用途类似荧光显微镜，但可以排除焦平面以外光的干扰，增强 图像反差和提高分辨率。 2、 应用：用于显示细胞样品的立体结构。 （五） 荧光共振能量转移技术 1、 基本原理：活体大分子之间相互作用会发出荧光，荧光强弱表 征相互作用的强度 2、 应用：检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作 用 （八）荧光漂白恢复技术 1、基本原理：利用高能量激光束的照射使特定区域的荧光发生

7、不 可逆的猝火。光漂白区荧光恢复可通过非漂白区的荧光标记分子在 几种常见光学显 微技术的原理及 其应用是重点， 相关应用的图 片、参考一些相 关研究的文献图 片展示；特别疋 相差显微镜技 术、荧光显微镜 技术 5 5 5 5 5 膜上或胞质运动到漂白区来完成。 2、应用：蛋白质定位、动力学及其其他成分相互作用等。 二、 电子显微镜 （一） 基本知识 1、 原理： 以电子束作光源， 电磁场作透镜。 电子束波长与加速电 压（通常50120KV）的平方根成反比 2、 组成：电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系 统、电源系统 3、应用及其特点：分辨力 0.2nm，放大倍数可达百万倍。用于观

8、察 超微结构（小于 0.2 （jm） （二） 主要电镜制样技术 1、 超薄切片：基本过程； 应用 2、 负染技术（Negative staining ）:基本过程及其应用 3、 冰冻蚀刻freeze-etching :基本过程及其 应用 4、 电镜二维重构技术：原理、 应用 5、 扫描电镜技术：原理、 应用 三、 扫描隧道显微镜 1、 原理：根据量子力学中的隧道效应设计。当原子尺度的针尖在不到 一个纳米的咼度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（ 2mV2V, 针尖与样品之间形成隧道电流。 电流强度与针尖和样品间的距离有函数关 系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸

9、形 态 2、 应用：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。属非破坏性 测量。是纳米生物学研究领域中的重要工具 四、 透射电镜 五、 扫描电镜技术 第二节细胞及其组分的分析方法 一、 用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 1、 分类 2、 应用：举例一一 DNA半保留复制的证明 二、 细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法 1、不同成分显示方法及其定位应用 三、 特异蛋白抗原的定位与定性 （一） 免疫荧光技术 1、原理；2、应用举例 （二） 免疫电镜技术 1、原理；2、应用举例 四、 细胞内特异核酸序列的定位与定性 五、 应用放射自显影技术研究大分子在细胞内的合成动态 六、

10、定量细胞化学分析技术 （一） 流式细胞仪 1、组成2、原理3、应用 （二） 显微分光光度测定技术 电子显微镜的原 理介绍清楚，二 者的区别都是难 点；重点是几种 方法的应用。通 过示意图展示。 几种电镜制样技 术需要收集视 频、相关研究的 图片展示， 简单 介绍原理；重点 理解几种技术的 应用和优势。 超速离心分离技 术举例： 相关研究文献资 料 重点介绍超速离 心分离；几种成 分的显示方法 （代表性的）、特 异蛋白抗体定位 于定性；流式细 胞仪 10 25 5 5 5 10 第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术 一、 细胞培养 （一） 动物细胞培养 1、 概念 2、 原代培养、传代培养、动

11、物细胞培养的过程 3、 动物细胞培养的应用 （二） 植物细胞培养 植物组织培养课程重点 （三） 非细胞体系在细胞生物学研究中的作用 二、 细胞工程 （一） 细胞融合与细胞杂交技术 （二） 单克隆抗体技术 （三） 细胞拆合与显微镜操作技术 第四节用于细胞生物学研究的模式生物 常见的几种模式生物 病毒、细菌、酵母菌、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、拟南芥等 小结： 重点知识点回顾 重要概念回顾 思考题 为什么说细胞培养室细胞生物学研究的最基本技术之一？ 分别介绍几种培 养方法的关键步 骤及其应用； 细胞工程的应用 及显微操作的重 要性 细胞工程课程中 是重点，这里简 单介绍下应用 模式生物的应用 重点介绍几种经 典模式生物：小 鼠、大肠杆菌等 总结： 理清思路， 抓住重点概念， 提示课后学习内 容，留思考题。 10 5 5 2 复习思考及作业题布置 1、 理解几种显微镜的原理及其区别 2、 举例说明几种显微镜的应用 3、 查阅相关资料，讨论细胞培养技术在科研和生产中的应用 授课的创新点： 参考资料（包括辅助教材、参考书、文献等） ： 1细胞生物学 郑国锠 主编，高等教育出版社，1999. 2. 细胞生物学 汪堃仁 主编