报道基因简介

1、报道基因SEAP 的应用一、报告基因的概况二、SEAP（分泌型碱性磷酸酶） 报告基因( reporter gene)是表型易于检测并易于与内源性背景蛋白质相区别的一类基因,常作为表示转录活性的指示分子。将报道基因与表达载体的启动子序列相连, 并转染到细胞内,通过胞外信号诱导在调控序列控制下进行表达，表达产物可以在细胞内细胞膜或细胞外直接释放信号或者催化特定的酶促反应间接释放信号，再通过特定的方法灵敏并且定量检出，即检测细胞内报道蛋白的含量或活性，从而直观地报告细胞内与基因表达有关的信号级联，即报道基因技术。可在基因表达的时空调控、受体特性、药物筛选和基因导入系统等研究中可广泛应用。理论基础 一

2、、报告基因概况 调控模型 报告基因种类繁多，选择何种报告基因应基于不同的研究目的、实验性质所用细胞系、产物检测的时空性和检测方法，此外还要考虑报告基因的稳定性、半衰期、灵敏度和线性范围。选择报告基因还需要考虑以下方面： 1）报告基因的产物和蛋白活性的定量检测方法容易建 立，快速简便，灵敏度高，重现性好； 2）在被转染的宿主细胞中不存在报告基因产物或类似 的内源性物质； 3）报告基因表达率与目的基因转录水平同步。 报告基因技术的优点是细胞内背景活性低,而且可以将细胞表面的信号放大,产生一个高敏感、易检测的反应 。 类型 报告基因从功能上基本可分为4 类： 1）以转运功能为主，持续转运放射性离子进

3、 入转导细胞； 2）选择性催化放射性或荧光底物发生反应 的酶蛋白； 3）不添加额外底物而发出自然荧光的荧光蛋 白； 4）能特异性捕获具有放射性、磁性或荧光标 记的配体，抗原或半抗原的锚定在膜上的受体 或抗体。从类别上，报告基因可分为1）氯霉素乙酰基转移酶2） -半乳糖苷酶3）荧光素酶4）分泌型碱性磷酸酶5）荧光蛋白家族 萤火虫荧光素酶、细菌荧光素酶以及荧光蛋白家族的绿荧光蛋白是目前在报告基因光学成像中最主要的3 种报告基因。二、SEAP（分泌型碱性磷酸酶） 分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase, SEAP)是人胎盘碱性磷酸酶(human placenta

4、l alkaline phosphatase, HPLAP)的突变体，也有部分来自北大西洋海域中的耐热细菌分离而得到的耐热型碱性磷酸酶。该酶能从表达的细胞内分泌到细胞外，对其编码产物的检测快速、简便、灵敏度高，且重现性好，因此具有作为报道基因的优良性质。原理 SEAP为HPLAP的突变体，缺乏羧基末端24个氨基酸，使得SEAP可全部分泌至细胞外，并无内源表达。因此对于SEAP的检测，无需破碎细胞，仅需用培养基即可检测酶活性，便于某些实时观测定量型的试验。 酶活性检测时， 1）以间硝基苯磷酸(PNPP)为底物、操作简单、反应时间短、但灵敏度较低。 2）以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为底物进行比色

5、测定，灵敏度增高。 3）使用化学发光法进行检测，线性范围比半乳糖苷酶高56个数量级。 SEAP的应用1.中和实验：原理：基于原发性免疫对病毒侵袭进行保护。几种中和抗体检测方法：1）分泌型碱性磷酸酶中和法： 一种体外高通量且灵敏检测中和抗体效价的方法。2）酶联免疫法(ELISA)：一种高度重复的定量体液反应中特异性抗体的快速检测方法。基本原理： 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

6、用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 传统细胞病变观察： 以50%细胞病变稀释度为中和血清滴度的测定方法。观察与判定细胞病变的时间，大约在310天间。基于SEAP的细胞病变检测： 以SEAP报道基因为基础的化学发光法检测5型腺病毒的中和血清滴度时，在24小时内便可得到结果。 原因：SEAP是对侵入细胞病基因的表达

7、产物做出的检测，该产物在细胞生长液中的出现是伴随侵入病毒早期基因的转录与表达而出现的。这在时间上会远远早于细胞结构因病毒扩增而引起病变现象。3）细胞病变观察2. 基因工程抗体人源化与检测鼠源抗体人源化的原因： 单克隆抗体和多克隆抗体已经被广泛的应用，但由于它们是异源蛋白，不能直接用于人体内，否则会产生很强的免疫应答。实例： 运用分子间拼接技术，将COS-1细胞中鼠源IgM Fab区与人源SEAP成功融合表达并对活性进行检测。由于SEAP对于某些底物含量的识别可以达到10-21，该结果还适用于各种酶与抗体相连的ELISA检测。同时，此方法对抗体介导酶-前体药物疗法的研究有一定的参考价值。3.定量

8、检测某些与免疫应答相关或抵御病毒的细胞因子的生产中，定量生物鉴定方法主要有：1）抗病毒检测法(anti-viral assay, AVA)。该方法具有较高 的变化性从而影响检测，造成被检测产品内在与批次间 有较大的差异性。2）基于报道细胞系的报道基因检测法(reporter gene assay, RGA) 。检测细胞因子的 细胞系不仅可以通过SEAP实 时观测细胞因子的含量，较于AVA所要求的生物安全二 级条件，RGA对于操作环境并没有十分严格的要求，即 可得到一个更为准确的结果。4. 基因投递检测理论基础：不同的细胞所能接受并高效表达的外源基因水平 各不相同。目的：为快速研究所需要的细胞内

9、能否直接高效稳定表达所 需蛋白质。方法：将SEAP连接至所用基因载体后端，转染至细胞观察 所一定时间内细胞表达SEAP的水平的变化。 双报道基因系统原理： 不同的报道基因有不同的特点，在此系统中信号是同时产生，测试是独立进行，有时反应也可按顺序促发。因此可以很好地发挥两种不同报道基因的检测优势。利用GFP或荧光素酶定位表达产物位置，同时利用SEAP精确确定表达量，使检测更准确、快速。1. SEAP与绿色荧光蛋白(GFP)GFP以及SEAP优缺点对比：GFP：无需损伤细胞即可研究细胞内变化，可直观地显示 研究对象的位置。但对于被研究对象的定量分析及实 时变化难以准确把握.SEAP：可方便定量且进

10、行实时分析。 两者报道基因相结合时候，有效地结合两者优点，既可直观观察真核细胞内的变化又可及时确定相关变化系数的准确值。实例： 为研究HCV的生命周期和与宿主细胞的相互作用，利用GFP和SEAP对HCV的感染过程和细胞内的复制情况进行了研究。设计了连接HCV、GFP和SEAP融合蛋白的基因。其中，GFP与SEAP之间使用24个碱基和HCV丝氨酸蛋白酶底物识别位点的基因连接。以利用病毒丝氨酸蛋白酶将两者分离，使SEAP分泌到培养基中，得以检查。 2. SEAP与荧光素酶原理：SEAP可催化D-荧光素-O-磷酸水解生成D-荧光素，后 者又可作为荧光素酶的底物，此即两步生物发光法检 测酶活性的原理。优点：此方法灵敏度高，接近于荧光素酶报道基因的检测。 还可用一步化学发光法检测酶活性。实例：利用此双生物标记的方法进行肌肉干细胞与肿瘤的体 内研究。依据此方法建立的临床癌症模型中，荧光素 酶标记可有效跟踪肌肉卫星细胞，从而反应