第4章细胞拆合与重组2

1、4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植4.6.1 4.6.1 克隆的概念克隆的概念4.6.2 4.6.2 鱼类、两栖类的细胞核移植鱼类、两栖类的细胞核移植4.6.3 4.6.3 哺乳类的细胞核移植哺乳类的细胞核移植4.6.44.6.4 克隆技术的应用与意义克隆技术的应用与意义4.6.5 4.6.5 正确看待克隆技术正确看待克隆技术4.6.6 4.6.6 克隆动物的现状和发展趋势克隆动物的现状和发展趋势4.6.1 4.6.1 克克 隆隆 clone:clone:指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体。在不发生突变的情况

2、下，它们生物个体的无性繁殖群体。在不发生突变的情况下，它们应该有相同的遗传结构。应该有相同的遗传结构。qcloning:cloning:通过克隆方式生产克隆群体的过程或手段。通过克隆方式生产克隆群体的过程或手段。克隆技术，无性繁殖的克隆技术，无性繁殖的操作过程（动词）操作过程（动词）无性繁殖群体（名词）无性繁殖群体（名词）含义外延含义外延无性繁殖的（产物无性繁殖的（产物 ） （形容词）（形容词）4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植 1997 1997年年3 3月，世界卫生组织月，世界卫生组织 克隆克隆遗传上同一机体或细胞系（株）的无性生殖。遗传上同一机体或细胞系（株）的无性生殖。 dn

3、adna分子、基因片断、单克隆抗体的复制也认为是克隆。分子、基因片断、单克隆抗体的复制也认为是克隆。4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植全全能性能性( (totipotencytotipotency) ) 细胞全能性细胞全能性指已经分化了的和尚未分化的细胞具有发育成完整指已经分化了的和尚未分化的细胞具有发育成完整有机体的各种组织的潜在能力的性质。有机体的各种组织的潜在能力的性质。4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植分化分化细胞细胞之全能性之全能性 已分化已分化细胞细胞的的细胞细胞核，仍能像胚胎核，仍能像胚胎细胞细胞般，含有引般，含有引导导生物完全生物完全发育发育的所有的所有遗传

4、讯息遗传讯息。 分化分化细胞细胞之全能性之全能性该该如何重新如何重新启动启动？4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植4.6.2 4.6.2 鱼类、两栖类的细胞核移植鱼类、两栖类的细胞核移植19521952年，美，年，美，robert briggs robert briggs 和和t.j.kingt.j.king 利用两栖类卵细胞建立细胞核移植技术利用两栖类卵细胞建立细胞核移植技术robert briggsrobert briggs4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植1955 1955 豹蛙豹蛙( (ranarana pipienspipiens) ) 囊胚细胞核囊胚细胞核 去核卵

5、母细胞去核卵母细胞 蝌蚪蝌蚪 可育的蛙可育的蛙4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植 1958-19621958-1962年，英年，英, , john gurdon john gurdon和和machineermachineer 爪蟾小肠上皮细胞核移植到未受精爪蟾小肠上皮细胞核移植到未受精 的卵细胞中，培养出可育的爪蟾的卵细胞中，培养出可育的爪蟾4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植 19701970年年,john gurdon,john gurdon 用青蛙作材料脚蹼角质化细胞进行细胞核移植试

6、验，蛙用青蛙作材料脚蹼角质化细胞进行细胞核移植试验，蛙卵发育成了蝌蚪卵发育成了蝌蚪4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植中国鱼类、两栖类动物克隆历史中国鱼类、两栖类动物克隆历史p 19611961年，金鱼和镑铍鱼，年，金鱼和镑铍鱼， 鱼类不同亚科间的细胞核移植鱼类不同亚科间的细胞核移植童第周童第周p19781978年，黑斑蛙成体红细年，黑斑蛙成体红细 胞的细胞核移入去核的未受胞的细胞核移入去核的未受 精卵中，发育成正常的蝌蚪精卵中，发育成正常的蝌蚪4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植1978 1978 黑斑蛙黑斑蛙 ( (童第周童第周)

7、 ) 蛙红细胞核蛙红细胞核 去核未受精卵细胞去核未受精卵细胞 蝌蚪蝌蚪4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植 19791979年，中国科学院武汉水生生物研究所年，中国科学院武汉水生生物研究所两尾幼鱼两尾幼鱼鲫鱼囊胚期细胞鲫鱼囊胚期细胞385385天天5959代连续传代培养代连续传代培养细胞核细胞核同种鲫鱼的未受精卵同种鲫鱼的未受精卵4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植19891989年，童第周、牛满江年，童第周、牛满江 鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去核的未受精卵鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去核的未受精卵 实现了不同种间的核质杂交。实现了不同种间的核质杂交。 培育出草鱼核培育出草鱼核+ +团头

8、鱼质的杂种鱼团头鱼质的杂种鱼4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植4.6.3 4.6.3 哺乳类的细胞核移植哺乳类的细胞核移植 艰难曲折过程艰难曲折过程卵细胞体积小卵细胞体积小 鼠鼠80m80m 兔兔125m125m 牛牛140 140 mm 人人100 100 mm 4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植显微操作仪（显微操作仪（micromanipulator)micromanipulator)4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植19771977年，美国，杰克逊实验室年，美国，杰克逊实验室 “亚无性繁殖亚无性繁殖”单亲小鼠单亲小鼠卵细胞受精卵细胞受精精卵核融合前，去精核精

9、卵核融合前，去精核双核卵细胞双核卵细胞双核融合，细胞分裂双核融合，细胞分裂胚胎移入母鼠子宫胚胎移入母鼠子宫7 7只单亲小鼠只单亲小鼠4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植19811981年，年，illmenseeillmensee和和hoppyhoppy 首次小鼠卵移核实验成功首次小鼠卵移核实验成功4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植illmenseeillmensee & hoppe & hoppe的克隆的克隆小鼠实验小鼠实验收集囊胚期细胞收集囊胚期细胞团分散成单细胞团分散成单细胞细胞核受体细胞核受体 细胞核供体细胞核供体收集受精卵收集受精卵去核去核融合融合甲品

10、种小鼠甲品种小鼠乙品种小鼠乙品种小鼠取核取核融合融合4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植将核注入已去核将核注入已去核的受精卵中的受精卵中在培养皿中培养至细胞团在培养皿中培养至细胞团植入假母子宫植入假母子宫产出小鼠产出小鼠核移植小鼠（克隆小鼠）核移植小鼠（克隆小鼠） 长成成鼠，呈核供体小鼠性状长成成鼠，呈核供体小鼠性状 克隆小鼠实验步骤克隆小鼠实验步骤a.a.供体胚胎细胞核的制备供体胚胎细胞核的制备b.b.受体受精卵的制备受体受精卵的制备c.c.细胞核移植细胞核移植d.d.克隆鼠的培养克隆鼠的培养4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植a. a. 供核胚胎的制备供核胚胎的制备 取纯系

11、灰色小鼠作核供体亲鼠，正常交配妊娠第取纯系灰色小鼠作核供体亲鼠，正常交配妊娠第4 4天，从天，从雌鼠中收集胚泡，去透明带，使内细胞团与滋养层分离；将内雌鼠中收集胚泡，去透明带，使内细胞团与滋养层分离；将内细胞团和滋养层细胞分散成单个细胞。细胞团和滋养层细胞分散成单个细胞。采用妊娠第采用妊娠第4 4天的小白鼠胚胞，放入加有天的小白鼠胚胞，放入加有5ug5ugmlml的脱氧核的脱氧核糖核酸酶，糖核酸酶，1o1o毫克分子的毫克分子的n-2n-2羟乙基对二氮己烷羟乙基对二氮己烷-n-2-n-2乙烷磺酸，乙烷磺酸，1010牛胎儿血清牛胎儿血清darbecodarbeco改良改良eagleeagle氏液氏

12、液(dmem)(dmem)培养，除去透明培养，除去透明带，甩针分离营养细胞和内细胞团的细胞体，将这些细胞分离，带，甩针分离营养细胞和内细胞团的细胞体，将这些细胞分离，再将分离的细胞移到加有再将分离的细胞移到加有1010牛胎儿血清牛胎儿血清(dmem)(dmem)液中培养，保液中培养，保存在含有细胞松驰素存在含有细胞松驰素b b培养液中待用。培养液中待用。4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植b. b. 受体受精卵的制备受体受精卵的制备a)a)从从c57bl/6c57bl/6品系的黑色小鼠中收集受精卵品系的黑色小鼠中收集受精卵b)b)核移植的卵子从输卵管壶腹部采取受精卵，放入加有核移植的卵

13、子从输卵管壶腹部采取受精卵，放入加有1 1毫克毫升的牛睾丸玻璃酸酶毫克毫升的牛睾丸玻璃酸酶whittenwhitten氏培养液内，经氏培养液内，经5-10min5-10min除去卵丘层细胞，再放进加有除去卵丘层细胞，再放进加有5ug/ml5ug/ml的细胞松的细胞松驰素驰素b b的的whittenwhitten石腊培养液中培养石腊培养液中培养1h1h，待用，待用4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植c. c. 细胞核移植细胞核移植a)a)用用8m8m的微玻璃吸管插入受精卵将原来的雌、雄核两核的微玻璃吸管插入受精卵将原来的雌、雄核两核吸出吸出b)b)用微细管插入胚胎单细胞中把核吸出，然后移

14、入刚刚受用微细管插入胚胎单细胞中把核吸出，然后移入刚刚受精的黑色纯系核受体亲鼠受精卵精的黑色纯系核受体亲鼠受精卵c)c)这些核移植卵在新的这些核移植卵在新的whittenwhitten氏液内培养氏液内培养4-5d4-5d，发育到，发育到桑椹期或胚泡初期桑椹期或胚泡初期 4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植d. d. 克隆鼠的培养克隆鼠的培养a)a)植入植入icricr品系的白色假孕小鼠子宫内着床发育品系的白色假孕小鼠子宫内着床发育b)b)产下仔鼠（全部与产下仔鼠（全部与cba/ht-6cba/ht-6一样的灰色小鼠）一样的灰色小鼠）c)c)同功酶电泳分析，新生仔鼠具有供核个体的遗传性状

15、，同功酶电泳分析，新生仔鼠具有供核个体的遗传性状，而不持有供体细胞质的个体（黑色）或作为寄母的假而不持有供体细胞质的个体（黑色）或作为寄母的假孕（白色）的遗传性状孕（白色）的遗传性状4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植 19831983年，年，mcgrathmcgrath和和soltersolter首次利用显微操作技术和细胞首次利用显微操作技术和细胞融合技术，将单细胞期小鼠胚胎作为核供体进行核移植，融合技术，将单细胞期小鼠胚胎作为核供体进行核移植，得到了产仔，并建立了重复性很高的核移植程序，使得核得到了产仔，并建立了重复性很高的核移植程序，使得核移植效率大大提高。移植效率大大提高。 c

16、heongcheong等（等（19931993）发现细胞周期早期的胚胎细胞核在受体）发现细胞周期早期的胚胎细胞核在受体细胞质中可以发生发育程序的重排，核移植胚胎的发育率细胞质中可以发生发育程序的重排，核移植胚胎的发育率明显提高。明显提高。 有研究表明，小鼠囊胚期的滋养层细胞与有研究表明，小鼠囊胚期的滋养层细胞与icmicm细胞一样具细胞一样具有发育的全能性（有发育的全能性（tsundatsunda & kato, 1997; & kato, 1997; sotomarusotomaru et et al., 1999al., 1999）。）。4.6 4.6 动物细胞核移植动物细

17、胞核移植哺乳动物克隆方法哺乳动物克隆方法u胚胎分割胚胎分割u胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植u胚胎干细胞核移植胚胎干细胞核移植u胎儿成纤维细胞核移植胎儿成纤维细胞核移植u体细胞核移植体细胞核移植u胚胎嵌合胚胎嵌合4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植胚胎分割胚胎分割未着床早期胚胎，分割多等份未着床早期胚胎，分割多等份胚胎分割次数越多，所含细胞数越少，发育成胚胎分割次数越多，所含细胞数越少，发育成个体的能力越差个体的能力越差技术成熟，成功率高技术成熟，成功率高4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植未着床早期胚胎未着床早期胚胎单个细胞单个细胞去核未受精卵母细胞去

18、核未受精卵母细胞融合融合发育成胚胎发育成胚胎移入受体移入受体4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植胚胎干细胞核移植胚胎干细胞核移植胚胎干细胞系胚胎干细胞系具细胞全能性具细胞全能性结合细胞核移植技术结合细胞核移植技术4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植胎儿成纤维细胞核移植胎儿成纤维细胞核移植 19961996年，英，用此法克隆出年，英，用此法克隆出3 3只山羊只山羊4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植体细胞核移植体细胞核移植 19971997年年2 2月，英，爱丁堡罗斯林研究所，月，英，爱丁堡罗斯林研究所， 伊恩伊恩维尔穆特维尔穆特4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移

19、植 多利羊（多利羊（dolly)dolly)风暴风暴 199719972 227 27 nature 385nature 385：810810813 813 多利羊多利羊1996. 7 1996. 7 出生出生1996. 11 1996. 11 收到文章收到文章1997. 2 1997. 2 文章发表文章发表4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植多利羊成为明星多利羊成为明星4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植多莉与它的假母多莉与它的假母4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植4.6 4.6

20、 动物细胞核移植动物细胞核移植4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植克隆克隆“多利多利”成功成功q 解决了用体细胞做核供体与转基因的问题解决了用体细胞做核供体与转基因的问题4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植q 解决了使核供体细胞与核受体细胞（去核卵细胞）解决了使核供体细胞与核受体细胞（去核卵细胞） 同步的方法。同步的方法。 研究发现：研究发现： 在供体核植入受体胞质后，不管是供体还是受体，处在分在供体核植入受体胞质后，不管是供体还是受体，处在分裂中

21、期时更容易恢复全能性，原因可能有两个裂中期时更容易恢复全能性，原因可能有两个4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植1 1、如果供体核处于分裂中期，则供体核由于核膜的缺失，、如果供体核处于分裂中期，则供体核由于核膜的缺失， 使得受体的调控因子更容易与供体核发生接触而发生作使得受体的调控因子更容易与供体核发生接触而发生作 用。用。4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植2 2、如果受体处于分裂中期，则受体存在许多因子可以使得、如果受体处于分裂中期，则受体存在许多因子可以使得 供体核的核膜消失，从而调控更容易其作用，全能性更供体核的核膜消失，从而调控更容易其作用，全能性更 容易恢复容易恢复

22、 4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植“多利多利”的生物学意义的生物学意义u 证明一个已经完全分化的动物体细胞仍然保持着胚胎证明一个已经完全分化的动物体细胞仍然保持着胚胎 细胞的全部遗传信息细胞的全部遗传信息u 可以按照人的意志去改造、生产物种。可以按照人的意志去改造、生产物种。 u 利用克隆技术复制哺乳动物的技术障碍已被突破，利用克隆技术复制哺乳动物的技术障碍已被突破， 在理论上已成为可能。在理论上已成为可能。4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植19981998年年7 7月，美月，美国，国，夏威夷夏威夷大大学学 ryuzoryuzo yanagimachiyanagimach

23、i复制复制了五十了五十几双几双不同世代的不同世代的老鼠老鼠the honolulu techniquethe honolulu technique4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植胚胎成功胚胎成功发育发育的的关键关键p 染色染色体套数体套数是否能是否能维持维持正常正常p 胚胎胚胎发育过程发育过程中中正确正确的基因表現的基因表現调节调节 p 卵卵细胞细胞和和细胞细胞核核供应者两供应者两方的方的细胞周期阶段细胞周期阶段p 两两方之方之间间的的活动活动是否能互相配合是否能互相配合4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植4.6 4.6 动物细胞

24、核移植动物细胞核移植 19971997年年5 5月，月，wilmutwilmut等等 人人类类血液血液凝结凝结因子成功的因子成功的选殖选殖到到两只复制两只复制羊羊， mollymolly及及pollypolly。4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植多利和它的三个孩子多利和它的三个孩子4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植尚尚未未弄弄清的疑惑清的疑惑已分化已分化细细胞的胞的 dnadna，如何能，如何能够够被被逆转逆转回最初的受精卵回最初的受精卵时时期的期的状状态态？它的？它的机制机制是什是什么么？细细胞胞周期周期的相配的相配与与核移植核移植实验实验成功之成功之间间，真正的，真正的

25、连接机制连接机制又是又是如何？如何？复制复制羊（羊（cloned sheepcloned sheep）的成功）的成功并并不代表所有的哺乳不代表所有的哺乳类类都可能援都可能援用同用同样样方式方式4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植4.6.4 4.6.4 克隆技术的应用与意义克隆技术的应用与意义 检验动物细胞全能性检验动物细胞全能性 加速动物繁殖、优良育种、保护珍贵动物加速动物繁殖、优良育种、保护珍贵动物 医药领域（模拟疾病、基因治疗、器官移植等）医药领域（模拟疾病、基因治疗、器官移植等）4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植（1 1）技术尚不成熟）技术尚不成熟 成功率低成功率低 夭

26、折率高夭折率高4.6.5 4.6.5 正确看待克隆技术正确看待克隆技术4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植几个影响因素几个影响因素1 1、营养过多发育过快，克隆动物一般都有发育过快的问题，、营养过多发育过快，克隆动物一般都有发育过快的问题， 体外培养的时间过长或培养液的成分可能与克隆动物的体外培养的时间过长或培养液的成分可能与克隆动物的 流产以及出生后不久死亡有关流产以及出生后不久死亡有关4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植2 2、线粒体问题、线粒体问题 目前还不知道原本就存在于卵子里的线粒体到底在多大目前还不知道原本就存在于卵子里的线粒体到底在多大 程度上与个体的性质有关，细胞核的遗传基因与线粒体程度上与个体的性质有关，细胞核的遗传基因与线粒体 的遗传基因相互影响的问题必须引起重视。的遗传基因相互影响的问题必须引起重视。4.6 4.6 动物细胞核移植动物细胞核移植3 3、核的重新编程不完整，染色