分子荧光法测定维生素B2的含量

1、实验项目】分子荧光法定量测定维生素 B2 的含量【实验目的】1. 掌握标准曲线法定量分析维生素 B2 的基本原理。2. 了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作。【 实验原理 】荧光是光致发光。任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱 , 发射波长总是 大于激发波长。荧光激发光谱是通过测定荧光体的发光通量随波长变化而获得的 光谱，反映不同波长激发光引起荧光的相对效率。荧光发射光谱是当荧光物质在 固定的激发光源照射后所产生的分子荧光，是荧光强度对发射波长的关系曲线， 表示在所发射的荧光中各种波长相对强度。由于各种不同的荧光物质有它们各自 特定的荧光发射波长，可用它来鉴定荧光物质。有些

2、发荧光的物质其荧光强度与 物质的浓度成正比，故可用荧光分光光度法测定其含量。维生素B2溶液在430440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm附近。维生素B2在pH67的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素B2 溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素B2的含量。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质光黄素，光黄素也是一 个能发荧光的物质，其荧光比维生素 B2的荧光强得多，故测维生素 B2的荧光时 溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。在稀溶液中，荧光强度F与物质的浓度c有以下关系：F= 2.303 I0 & be当实验条件一定时，荧

3、光强度与荧光物质的浓度呈线性关系：F=Kc【仪器与试剂 】1. 仪器： 荧光分光光度计（型号： F2500 HITAH）；1cm 石英比色 皿；50mL容量瓶2. 试剂：维生素B2标准溶液（10.0卩g/mL）（已加乙酸）【实验内容与步骤】1. 系列标准溶液和待测溶液的配制取维生素 B2（ 10.0 卩 g/mL）标准溶液 1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL 分别置于50mL的容量瓶中，标定，摇匀。取2.00mL待测溶液于50mL的容量瓶中， 标定，摇匀。2. 激发光谱和荧光发射光谱的绘制（用 3.00mLd的标准溶液）设置入Em=520nr为发射波长，在25

4、0400范围内扫描，记录发射波长强度和 激发波长的关系曲线，便得到激发光谱。记录最大激发波长设置入Ex为最大激发波长即371 nm在400600nm范围内扫描，记录发射强 度与发射波长间的函数关系，便得到荧光发射光谱从荧光发射光谱上找出其最大 的发射波长入Em和荧光强度。3. 标准溶液及样品的荧光测定将激发波长固定在371 nm荧光发射波长为521 nm测量上述系列标准溶液的 荧光发射强度，按浓度从从低到高测定。在同样条件下测定未知溶液的荧光强度，并由标准曲线确定未知试样中维生素B2的浓度。【实验数据】1. 激发波长入Ex=371 nm 荧光发射波长 入Em=521 nm2. 标准溶液剂待测溶

5、液的浓度和荧光强度记录维生素B2溶液浓度（卩g/mL）0.20.40.60.81.0待测溶液相对荧光强度26.7051.7675.3598. 81121.050.38可得待测溶液的浓度为0.393卩g/mL.【实验图像】1. 以入Em=52（为发射波长，溶液浓度为0.6卩g/mL,在250400nm范围扫描得到的荧光强度和激发波长的关系曲线3. 设置激发波长为371 nm溶液浓度为0.6卩g/mL, 在 400600nm范围内扫描,所得发射强度与发射波长间的荧光发射光谱如下：hi 乖4005W祐Qm皿EndnrrlHe种Q綢9旳1旳1144H0JI血40213?a 52439 0521.D观Q

6、7.ESG3. 以激发波长入Ex=371 nm 荧光发射波长入Em=521 nm测量系列标准溶液浓度, 以标准溶液的荧光发射强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，制作标准曲线如 下:【结果分析与讨论】1. 石英皿是四面透光的，拿的时候不能接触到四个透光面，只能拿上下角部，擦 外壁残留液时由于擦镜纸不吸水，故可先用吸水纸巾擦干，再用擦镜纸擦。2. 本次实验所得到的R值为0.99977，而理论R值为1,相关度很接近，说明准确 度比较高，溶液配制比较准确。3. 配制好的溶液应尽快测量，避免久置成分变化而影响结果。4. 干扰荧光分光分光度法的因素：溶剂：同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质

7、。溶剂的极性 增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强 度增大。(2) 温度：升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。(3) PH :大多数含有酸性或碱性取代基团的芳香族化合物的荧光性质受 PH的影响很大。(4) 溶液表面活性剂的存在，减少非辐射跃迁的概率，提高了荧光效率。(5) 溶液中溶解氧的存在，由于氧分子的顺磁性质，使激发单重态分子向三重态的 体系间窜跃速率加大，因而会使荧光效率降低。【思考题】1、试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因？答:原因是由于现代电子技术具有检测十分微弱光信号的能力，并且荧光强度与 激发光强度成正比，提高激发光强度也可以增大荧光强度，使测定的灵敏度提高； 而吸收光度法测定的是吸光度，不管是增大入射光强度，还是提高检测器的灵敏 度，都会使透射光信号与入射光信号以同样的比例增大，吸光度值不会改变，因 此灵敏度不能提高。2、维生素B2在pH=67时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定