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1、 第14章 色谱分析法Chromatography(之一之一)主讲教师:朱祥兵主讲教师:朱祥兵目目 录录14-1 概述概述14-2色谱法基本概念及有关术语色谱法基本概念及有关术语14-3 色谱法基本理论色谱法基本理论14-4 色谱分离优化色谱分离优化14-5 定性分析和定量分析定性分析和定量分析第一节第一节 色谱分析概论色谱分析概论问题问题问题问题1:什么是色谱法?:什么是色谱法?问题问题2:为什么色谱法能将混合物分开?:为什么色谱法能将混合物分开?问题问题3:色谱法的分类?:色谱法的分类?问题问题4:各种色谱法的应用范围?:各种色谱法的应用范围?1、什么是色谱法?茨维特(M.S.Tswett
2、): 俄国植物学家,主要从事植物色素的研究工作色谱之父茨维特的实验 1901一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用 1906 年发表的文章中,首次提出了色谱的概念。利用混合物中不同组分在两相之间进行不同分配的原理,使混合物分离,并进行定性和定量分析的方法。因此因此 色谱法是一种色谱法是一种分离分离方法。方法。 它的特点是:有两相,一是固定相,一是流动相,它的特点是:有两相,一是固定相,一是流动相,两相作相向运动。两相作相向运动。 Chromatography 将色谱法用于分析中,则称为色谱分析。将色谱法用于分析中,则称为色谱分析。 色谱分析是一种分离、分析法。色谱分析是一种分离、分析法。色谱的
3、发展 液固色谱 Tiselius和Claesson,瑞典科学家,改进色谱方法,1948年诺贝尔化学奖A.W. K.Tiselius19021971 分配色谱 Martin和Synge,英国科学家,提出分配法,1952年诺贝尔化学奖 气相色谱 Martin和James,1951年通过实验证明气液色谱可行性。A. J. P. Martin19102002R. L. M. Synge19141994 2、色谱法分离原理 当流动相中所携带的混合物流过固定当流动相中所携带的混合物流过固定相时,就会和固定相发生作用相时,就会和固定相发生作用( (力的作用力的作用) )。由于混合物中各组分在由于混合物中各组
4、分在性质和结构性质和结构上有差上有差异,与固定相发生异,与固定相发生作用的大小作用的大小也有差异。也有差异。因此在同一推动力作用下,不同组分在固因此在同一推动力作用下,不同组分在固定相中的滞留时间有长有短,从而按先后定相中的滞留时间有长有短,从而按先后不同的次序从固定相中流出不同的次序从固定相中流出。3、色谱法的分类 按按流动相状态流动相状态的不同,可分为的不同,可分为气相色谱法气相色谱法 (GC)液相色谱法液相色谱法 (LC)超临界流体色谱超临界流体色谱 (SFC)什么是气相色谱法? 以气体为流动相的色谱法以气体为流动相的色谱法 Gas Chromatogaphy,简称简称GC 按固定相状态
5、的不同可分为:按固定相状态的不同可分为: 气固色谱气固色谱(GSC) 气液色谱气液色谱(GLC) 适合分离分析适合分离分析易汽化易汽化(在(在- 190-500范围内有范围内有0.2-10mmHg的蒸气压的)的蒸气压的)稳定、不易分解、不易反应稳定、不易分解、不易反应的的样品,特别适合用于样品,特别适合用于同系物、同分异构体同系物、同分异构体的分离。的分离。什么是液相色谱法? 以液体为流动相的色谱法以液体为流动相的色谱法 Liquid Chromatogaphy,简称简称LC 适合分离分析高沸点、热不稳定、离适合分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。子型的样品。按按固定相固定相使用的形式可分
6、为使用的形式可分为柱色谱(柱色谱(Column Chromatography) 将固定相装在色谱柱内将固定相装在色谱柱内纸色谱(纸色谱(Paper Chromatography) 用滤纸做固定相或固定相载体的色谱用滤纸做固定相或固定相载体的色谱薄层色谱(薄层色谱(Thin Lay Chromatography) 固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上 按分离机理分类 利用组分在吸附剂(固定相)上的吸附利用组分在吸附剂(固定相)上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法,称为能力强弱不同而得以分离的方法,称为吸附色谱法吸附色谱法。 利用组分在固定液(固定相)中溶解度利用组分在固定
7、液(固定相)中溶解度不同而达到分离的方法称为不同而达到分离的方法称为分配色谱法分配色谱法。 利用组分在离子交换剂(固定相)上的利用组分在离子交换剂(固定相)上的亲和力大小不同而达到分离的方法,称亲和力大小不同而达到分离的方法,称为为离子交换色谱法离子交换色谱法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法,称为择渗透而达到分离的方法,称为凝胶色谱凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。法或尺寸排阻色谱法。 最近,又有一种新分离技术,利用不同组最近,又有一种新分离技术,利用不同组分与固定相(固定化分子)的高专属性亲分与固定相(固定化分子)的高专属性亲和力进行
8、分离的技术称为和力进行分离的技术称为亲和色谱法亲和色谱法,常,常用于蛋白质的分离。用于蛋白质的分离。按流动相分气相色谱(GC)液相色谱(LC)超临界流体色谱(SFC)按机理分吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱按固定相在支持体中的形状分柱色谱平板色谱纸色谱薄层色谱第二节第二节 色谱法基本概念及有关术语色谱法基本概念及有关术语(一)色谱流出曲线和色谱峰(一)色谱流出曲线和色谱峰 由检测器输出的信号强度对时间作图,所得曲由检测器输出的信号强度对时间作图,所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。峰。 如果进样量很小,浓度很低,在吸附等温线(如果进
9、样量很小,浓度很低,在吸附等温线(气固吸附色谱)或分配等温线(气液分配色谱)气固吸附色谱)或分配等温线(气液分配色谱)的线性范围内,则色谱峰是对称的。的线性范围内,则色谱峰是对称的。峰峰高基线峰宽半峰宽峰面积标准偏差(二)基线(二)基线 在实验操作条件下,在实验操作条件下,色谱柱后没有样品组分色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线流出时的流出曲线称为基线,稳定的基线应,稳定的基线应该是一条水平直线。该是一条水平直线。(三)峰高(三)峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离,以(色谱峰顶点与基线之间的垂直距离,以(h)表示。表示。 色谱流出曲线和色谱峰色谱流出曲线和色谱峰 基线(基线(a) 峰
10、高(峰高(h)(四)保留值(四)保留值 1.死时间死时间tM 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时,从进样到出现峰极大值所需的时柱时,从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间,它正比于色谱柱的空隙间称为死时间,它正比于色谱柱的空隙体积,如下图体积,如下图。 因为这种物质不被固定相吸附或因为这种物质不被固定相吸附或溶解,故溶解,故其流动速度将与流动相流动其流动速度将与流动相流动速度相近。速度相近。测定流动相平均线速测定流动相平均线速时,时,可用柱长可用柱长L与与tM的比值计算,即的比值计算,即 = L/tM2. 保留时间tR 试样从进样到柱后出现峰极大点时所经
11、过的时间,称为保留时间,如下图。3.调整保留时间调整保留时间tR 某组分的保留时间扣除死时间后,称为某组分的保留时间扣除死时间后,称为该组分的该组分的调整保留时间调整保留时间, 即即 tR = tR tM 由于组分在色谱柱中的保留时间由于组分在色谱柱中的保留时间tR包含了包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所须的时间,在固定相中滞留所须的时间,所以所以tR实际实际上是组分在固定相中保留的总时间。上是组分在固定相中保留的总时间。 保留时间是色谱法定性的基本依据,保留时间是色谱法定性的基本依据,但同一组分的保留时间常受到流动相流但同一组分的保
12、留时间常受到流动相流速的影响,因此色谱工作者有时用保留速的影响,因此色谱工作者有时用保留体积来表示保留值。体积来表示保留值。4.死体积死体积V0 指色谱柱在填充后,柱管内固定相颗指色谱柱在填充后,柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小可忽略不计时,。当后两项很小可忽略不计时,死体积死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速可由死时间与色谱柱出口的载气流速Fco(cm3min-1)计算计算。 V0 = tMFc0 式中式中 Fc0为扣除饱和水蒸气压并为扣除饱和水蒸气压并经温度
13、校正的流速。经温度校正的流速。仅适用于气相色仅适用于气相色谱谱,不适用于液相色谱,不适用于液相色谱。5. 保留体积保留体积VR 指从进样开始到被测组分在指从进样开始到被测组分在柱后出现浓柱后出现浓度极大点度极大点时所通过的流动相的体积。保时所通过的流动相的体积。保留时间与保留体积关系:留时间与保留体积关系: VR= tR Fco 6.调整保留体积调整保留体积VR 某组分的保留体积扣除死体积后,称为某组分的保留体积扣除死体积后,称为该组分的调整保留体积。该组分的调整保留体积。 VR = VR V0 = tR Fco 7.相对保留值相对保留值r2,1 某组分某组分2的调整保留值与组分的调整保留值与
14、组分1的调整保留的调整保留值之比,称为相对保留值。值之比,称为相对保留值。 r2,1= tR2 / tR1 = VR2 / VR1 由于相对保留值只与柱温及固定相性质有由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关,而与柱径、柱长、填充情况及流动相关,而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关,因此,它在色谱法中,特别是流速无关,因此,它在色谱法中,特别是在气相色谱法中,广泛在气相色谱法中,广泛用作定性的依据用作定性的依据。 在定性分析中,通常固定一个色谱峰在定性分析中,通常固定一个色谱峰作为标准(作为标准(s),),然后再求其它峰(然后再求其它峰(i)对对这个峰的相对保留值,此时可用符号这个峰的相对保
15、留值,此时可用符号 表表示,即示,即 = tR (i) / tR (s) 式中式中tR (i)为后出峰的调整保留时间,所为后出峰的调整保留时间,所以以 总是大于总是大于1的。相对保留值往往可作为的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标,又称选择因子衡量固定相选择性的指标,又称选择因子。 (五五) 区域宽度区域宽度 色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一,用于衡量柱效率及反映色要参数之一,用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有区域宽度通常有三种方法三种方法。1.标准偏差标准偏差 即即0
16、.607倍峰高处色谱峰宽倍峰高处色谱峰宽的一半。的一半。2.半峰宽半峰宽W1/2即峰高一半处对应的峰宽。它与即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为标准偏差的关系为 W1/2=2.354 3.峰底宽度峰底宽度W即色谱峰两侧拐点上的切线在基即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差线上截距间的距离。它与标准偏差 的关系是的关系是 Y = 4 从色谱图中可以获得的从色谱图中可以获得的信息信息 a. 色谱峰个数色谱峰个数 b. 色谱保留值色谱保留值 c. 色谱峰面积或峰高色谱峰面积或峰高 d. 保留值与区域宽度保留值与区域宽度 e. 两峰间距两峰间距 色谱分析的色谱分析的目的目的
17、是将样品中是将样品中各组分彼此分离各组分彼此分离,组分,组分要达到完全分离,两峰间的距离必须足够远,两峰间要达到完全分离,两峰间的距离必须足够远,两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的,即与色的距离是由组分在两相间的分配系数决定的,即与色谱过程的热力学性质有关。谱过程的热力学性质有关。 但是两峰间虽有一定距离,如果每个峰都很宽,以但是两峰间虽有一定距离,如果每个峰都很宽,以致彼此重叠,还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组致彼此重叠,还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的,即与色谱过程分在色谱柱中传质和扩散行为决定的,即与色谱过程的动力学性质有关。因此,的动力学性
18、质有关。因此,要从热力学和动力学两方要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。面来研究色谱行为。 (六)分配系数(六)分配系数K和分配比和分配比k1.分配系数分配系数K 分配色谱的分离是基于样品组分在固定相分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分配过程,而吸附和流动相之间反复多次的分配过程,而吸附色谱的分离是基于反复多次的色谱的分离是基于反复多次的吸附吸附-脱附脱附过程过程。 这种分离过程经常用样品分子在两相间的这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述,而描述这种分配的参数称为分分配来描述,而描述这种分配的参数称为分配系数配系数K。 它(它(K)是指在一定温度和压力下,
19、组是指在一定温度和压力下,组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值,即度之比值,即 (柱温)量每毫升流动相上溶质的溶质的量或吸附每毫升固定相上溶解.)(K 分配系数是由组分和固定相的热力分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的,它是每一个溶质的特征学性质决定的,它是每一个溶质的特征值,它仅与两个变量有关:值,它仅与两个变量有关:固定相和温固定相和温度度。与两相体积、柱管的特性以及所使。与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关。用的仪器无关。2.分配比分配比 k 分配比又称分配比又称容量因子容量因子,它是指在一定温,它是指在一定温度和压力下,组分
20、在两相间分配达平衡度和压力下,组分在两相间分配达平衡时,分配在固定相和流动相中的物质的时,分配在固定相和流动相中的物质的量比。即量比。即 msnnk的量组分在流动相中的物质的量组分在固定相中的物质 k值越大,说明组分在固定相中的量越值越大,说明组分在固定相中的量越多,相当于柱的容量大,因此又称多,相当于柱的容量大,因此又称分配容分配容量或容量因子量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。组分保留能力的重要参数。k值也决定于组值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化,而且还与流动相及固定柱压变化而
21、变化,而且还与流动相及固定相的体积有关。相的体积有关。 k = ns / nm =CsVS / CmVm 式中式中cs,cm分别为组分在固定相和流动分别为组分在固定相和流动相的浓度;相的浓度;Vm为柱中流动相的体积,近似为柱中流动相的体积,近似等于死体积。等于死体积。Vs为柱中固定相的体积为柱中固定相的体积,在在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如:在分配色谱中,例如:在分配色谱中,Vs表示固定液的表示固定液的体积;在尺寸排阻色谱中,则表示固定体积;在尺寸排阻色谱中,则表示固定相的孔体积。相的孔体积。 分配比分配比 k 值可直接从色谱图中测得值可直接从色
22、谱图中测得。 k = (t R t M ) / t M = t R / t M = V R / V 0 3. 分配系数分配系数K与分配比与分配比 k 的关系的关系 K = kVS/VM =k . 其中其中称为相比称为相比,它是各种色谱柱柱型,它是各种色谱柱柱型和结构的特征参数。例如,对填充柱,和结构的特征参数。例如,对填充柱,其其值一般为值一般为6-35;对毛细管柱,其;对毛细管柱,其值值为为60-600。 4.分配系数分配系数 K 及分配比及分配比 k 与选择因子与选择因子(相对保(相对保留值)的关系留值)的关系 对对A、B两组分的选择因子,用下式表示:两组分的选择因子,用下式表示: = t R (B) / t R (A) = k(A) / k(B) =K(A) / K(B) 通过选择因子通过选择因子把实验测量值把实验测量值k与热力学性质与热力学性质的分配系数的分配系数K直接联系起来,直接联系起来,对固定相的选择具对固定相的选择具有实际意义。有实际意义。 如果两组分的如果两组分的K或或k值相等,则值相等,则=1,两个组分的色谱峰必将重合,两个组分的色谱峰必将重合,说明分不开。两组分的说明分不开。两组分的K或或k值相差值相差越大,则分离得越好越大,则分离得越好。因此两组分。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的具有不同
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