第五章酶与细胞的固定化技术

1、第五章第五章 酶与细胞的固定化技酶与细胞的固定化技术术酶应用过程中的一些不足酶应用过程中的一些不足 酶的稳定性较差酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如-淀粉酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。 酶的一次性使用酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。 产物的分离纯化较困难产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化

2、带来一定的困难。 固定化技术固定化技术酶的固定化酶的固定化 1 1、什么是固定化技术和固定化酶、什么是固定化技术和固定化酶2 2、固定化酶的研究历史、固定化酶的研究历史3 3、酶的固定化技术、酶的固定化技术4 4、固定化酶的特点、固定化酶的特点GoGoGoGo 固定化生物技术固定化生物技术 通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。复利用。 1.1.酶酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。机溶剂对其有影响）。2.2.不能回收，也使

3、产物中混杂酶蛋白。不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。3.3.分离纯化困难。分离纯化困难。 游离酶的缺点：游离酶的缺点：什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术固定化酶 固定化酶：是指借助物理或化学方法将酶固定在载体上，并在一定的空间内进行催化反应的酶。固定化酶可以连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。 固定化酶形状：颗粒、线条、薄膜和酶管等。 固定化菌体 优点：1）可提高稳定性；2）能回收，易与产物分离，可反复使用；3）可连续化生产操作；4）可实现最优化控制；5）酶可以再生利用。 缺点：1）酶固

4、定化后酶活力有损失；2）只能用于可溶性小分子底物；3）与完整细胞比较，不适于多酶反应。制备固定化酶的依据制备固定化酶的依据 固定化酶必须能保持酶原有的专一性、高效催化能力和常温、常压下能起催化反应等特点。 固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。 固定化酶应用于机械化和自动化操作，所用载体常有一定的机械强度。 固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。即要保护活性中心基团。 固定化酶应能最大程度与底物接近，从而提高产量。具有最小的空间位阻。 固定化酶应有最大的稳定性。 定化酶应易与产物分离。固定化方法固定化方法 吸附法吸附法 结合法结合法 交联法交联法 包埋法包埋法网格型网格型微微囊型囊型共价键共

5、价键结合法结合法离子键离子键结合法结合法酶的固定化方法 1 1、吸附法、吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。定化的方法。 常用的固体吸附剂有常用的固体吸附剂有活性炭、活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。等。 操作简便，条件温和，不会引操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。且可反复使用。 由于靠物理吸附作用，由于靠物理吸附作用，结合力结合力较弱较弱，酶与载体结合

6、不牢固而容易，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。脱落，所以使用受到一定的限制。 优点：优点：条件温和，操作简条件温和，操作简便，酶活力损失少。便，酶活力损失少。缺点：缺点：结合力弱，易解吸结合力弱，易解吸附附。 2、结合法、结合法选择适宜的载体，使之通过共价键或离子选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法。键与酶结合在一起的固定化方法。根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：离子键结合法离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。离子键结合法所使

7、用的载体是某些不溶于水的离子交换键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有剂。常用的有DEAE-DEAE-纤维素纤维素、TEAE-TEAE-纤维素纤维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶等。等。 共价键结合法共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有：合法。共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素纤维素、琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶、葡聚糖葡聚糖凝胶凝胶、甲壳质甲壳质、氨基酸共聚物氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物甲基丙稀醇共聚物等。等。酶分子中可以形成共价键的基团主要

8、有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化载体活化。第一个离子结合法固定化酶：第一个离子结合法固定化酶：DEAE-Cellulose固定化过氧化氢酶固定化过氧化氢酶第一个工业化的固定化酶：第一个工业化的固定化酶：DEAE-Sephadex A-50固定化氨基酰化酶固定化氨基酰化酶 借助共价借助共价键将酶的活性键将酶的活性非必需侧链基非必需侧链基团和载体的功团和载体的功能基团进行偶能基团进行偶联。联。共价结合法（共价结合法（covalent b

9、inding covalent binding or covalent couplingor covalent coupling） 1 1）载体：）载体：亲水载体优于疏水载体亲水载体优于疏水载体 如如: :天然高分子衍生物天然高分子衍生物: : 纤维素纤维素 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差亲和性好，机械性能差 琼脂糖琼脂糖 合成聚合物：合成聚合物： 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚苯乙烯聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构机械性能好，但有疏水结构 尼龙尼龙 使载体活化的方法很多，主要使载体活化的方法很多，主要的有：重氮化法、叠氮法、溴化氰的有：重氮化法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。法、烷基

10、化法等。优点：优点：酶与载体结合牢固，不会轻易酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。脱落，可连续使用。缺点：缺点：反应条件较激烈，易影响酶的反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。空间构象而影响酶的催化活性。 3 3、交联法、交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法定化酶的方法。戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫（应，形成席夫（SchiffSchiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定）碱，而使

11、酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。化酶或固定化菌体。交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态。酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态。交联法制备的固定化酶或固定化菌体交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固结合牢固，可以长时间使用。，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶酶活力损失较大活力损失较大，而且制备

12、成的固定化酶或固定化菌体的，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小颗粒较小，给使用带来不便。为此，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短以取长补短。 常用的双功能试剂有戊二醛、常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。戊二醛。酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶 缺点：缺点：(1)(1)反

13、应条件激烈，酶分子的多个基团反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。被交联，酶活力损失大。(2)(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。带来不便。 4. 4. 包埋法包埋法 将酶用物理的方法将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚包埋在各种载体（高聚物）内。分为：物）内。分为：网格型：网格型：将酶包埋在高将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。分子凝胶细微网格中。微囊型：微囊型：将酶包埋在高将酶包埋在高分子半透膜中。分子半透膜中。1）网格型包埋法网格型包埋法（gel (latticgel (lattic) entrapment) entrapment） 又称

14、凝胶包埋法又称凝胶包埋法凝胶凝胶包埋条件包埋条件 酶活性酶活性强度强度天然凝胶天然凝胶琼脂、海藻酸钙、琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶角叉菜胶、明胶温和温和不变不变差差合成凝胶合成凝胶聚丙烯酰胺、光聚丙烯酰胺、光交联树脂交联树脂聚合反应聚合反应 部分失活部分失活 高高使用的多孔载体及其特点使用的多孔载体及其特点海藻酸钙凝胶包埋法：海藻酸钙凝胶包埋法： 滴至滴至海藻酸钠溶液海藻酸钠溶液E (or cell) CaCl2 溶液中溶液中 IE(or IC) 角叉菜胶包埋法：角叉菜胶包埋法： 滴至滴至角叉菜胶角叉菜胶E (or cell) KCl 溶液中溶液中 IE (or IC)聚丙烯酰胺凝胶包埋法：

15、聚丙烯酰胺凝胶包埋法： APAcr+ Bis+E (or cell) IE (or IC) TEMED2 2）微囊型包埋法）微囊型包埋法（microencapsulationmicroencapsulation） 又称半透膜包埋法又称半透膜包埋法 将一定量酶液包在半透性的高分子将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内微孔膜内 。半透膜：直径几十微米到几。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约百微米，厚约25nm25nm。 半透膜孔径半透膜孔径 酶分子孔径，小于半透酶分子孔径，小于半透膜孔径的小分子底物和产物可以自由进膜孔径的小分子底物和产物可以自由进出，被称为出，被称为“人工细胞人工细胞”。 与网

16、格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：1 1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。2 2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。 缺点：缺点：反应条件要求高反应条件要求高, ,制备成本也较高。制备成本也较高。 包埋法是目前应用最多的一种较理想的方包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：法，与其它固定

17、化方法相比：优点：优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。酶的高级结构，酶活回收率高。缺点：缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。只适合作用于小分子底物和产物的酶。 吸附法吸附法 结合法结合法 交联法交联法 包埋法包埋法 酶的四种固定化方法酶的四种固定化方法固定化方法固定化方法吸附法吸附法包埋法包埋法结合法结合法交联法交联法制备难易制备难易易易较难较难难难较难较难结合程度结合程度弱弱强强强强强强活力回收活力回收高，酶易流高，酶易流失失高高低低中等中等再生再生可能可能不能不能不能不能不能不能费用费用低低低低高高中等中等底物专一性底物

18、专一性 不变不变不变不变可变可变可变可变各种固定化方法的优缺点比较各种固定化方法的优缺点比较固定化酶性质 固定化对酶稳定性影响：1）对热稳定性提高；2）对变性剂、抑制剂的耐受性提高；3）对蛋白酶抵抗能力增加、储存稳定性和操作稳定性有所增强。 最适温度：一般与游离酶相似。 最适pH：受载体带电性和产物性质等最适pH会受一定影响。 底物特异性：是否变化与底物的分子质量大小有一定关系。 米氏常数：固定化酶的表观米氏常数随载体带电性能而变化。固定化酶操作的注意事项固定化酶操作的注意事项 活性中心活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级

19、结构不受到损害，在制备固定化酶时，酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。需要在非常严密的条件下进行。 功能基团功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合定化结合 酶的高级结构酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，

20、因此，操作有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。应尽量在非常温和的条件下进行。分类方式分类方式 固定化细胞固定化细胞 分类方式分类方式固定化细胞固定化细胞细胞类型细胞类型微生物微生物植物植物动物动物生理状态生理状态死细胞死细胞: :完整细胞完整细胞, ,细胞碎片细胞碎片, , 细胞器细胞器活细胞活细胞: :增殖细胞增殖细胞, ,静止细胞静止细胞, , 饥饿细胞饥饿细胞细胞的固定化方法细胞的固定化方法 1) 1) 直接固定法直接固定法 不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接化

21、学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。固定。 一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。 2)2)吸附法吸附法 3)3)包埋法包埋法 2. 2. 固定化方法固定化方法 与固定化酶相比，固定化细胞的情与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。况比较复杂。 （1 1）有活性升高的现象。）有活性升高的现象。（2 2）稳定性的增加）稳定性的增加 。（3 3）最适温度和最适）最适温度和最适pHpH常保持不变。常保持不变。固定化细胞的特点固定化细胞的特点 固定化酶（细胞）的评价指标（一） 固定化酶（细胞）活力：固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进

22、后才能用于测定固定化酶。 通常采用间歇测定和连续测定方法。 蛋白总量：1）双辛可宁酸法(BCA法) ；2）考马斯亮蓝法 。 半衰期：在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示，是衡量稳定性的一项重要指标。 如果耦联率与酶活力回收率相近，则表明固定化方法对酶活力没有明显影响。固定化酶（细胞）的评价指标（二） 偶联率=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/加入蛋白活力100% 活力回收率=固定化酶总活力/加入酶的总活力100% 相对活力=固定化酶总活力/ (加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力)100%乙酰乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酸

23、乙酰乙酰 -D Ala固定化酶与固定化细胞的应用固定化酶与固定化细胞的应用 一、在工业生产上的应用一、在工业生产上的应用 1. 氨基酰化酶（氨基酰化酶（Aminoacylase） 世界上第一种工业化生产的固定化酶世界上第一种工业化生产的固定化酶泵泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器固定化固定化酶柱子酶柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala 2.2.葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶 世界上生产规模世界上生产规模最大，应用最为成功最大，应用最为成功的一种固定化酶。的一种固定化酶。二、固定化酶在医学上的应用二、固定化酶在医学上的应用 1. 消血栓：消血栓：n纤

24、溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。反应，无法长期使用。n酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。 用包埋法制备的酶固定化技术可克服上用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。能自由进出。2. 2. 人工肾：人工肾：原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。和微胶囊活性炭组成人工肾。1.1.酶传感器酶传感器

25、固定化酶和电化学传感器的结合。固定化酶和电化学传感器的结合。 优点：优点：既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；电极的高灵敏度；酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定能够直接在复杂试样中进行测定。 三、在分析检测中的应用三、在分析检测中的应用 19671967年年UpdikeUpdike等采用酶的固定化等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器世界上第一个生

26、物传感器葡萄糖葡萄糖氧化酶电极氧化酶电极。 葡萄糖酶电极 酶电极示意图D葡萄糖葡萄糖O2 D葡萄糖酸葡萄糖酸1，5内酯内酯H2O2半透膜酶胶层感应电极GlucoseGluconic acidGlucose oxidaseOxygenHydrogen peroxideMembraneElectrode 根据反应中消耗的根据反应中消耗的O O2 2、生成的葡萄糖酸和、生成的葡萄糖酸和H H2 2O O2 2的量，的量，可以用氧电极、可以用氧电极、pHpH电极和电极和H H2 2O O2 2电极来测定葡萄糖的含量。电极来测定葡萄糖的含量。 继酶传感器（继酶传感器（enzyme sensorenzym

27、e sensor）后，又出现：）后，又出现： 细胞器传感器（细胞器传感器（cell organelle sensorcell organelle sensor） 组织传感器（组织传感器（tissue sensortissue sensor） 微生物传感器（微生物传感器（microbe sensormicrobe sensor） 免疫传感器（免疫传感器（immunosensorimmunosensor）1）酶传感器的原理）酶传感器的原理 生物传感器生物传感器 由生物识别单元（如酶、微生物、抗由生物识别单元（如酶、微生物、抗体等）和物理转换器相结合所构成的分体等）和物理转换器相结合所构成的分析仪器

28、。析仪器。生物识别元件生物识别元件(Biological recognition element)(Biological recognition element) 是酶、抗原是酶、抗原( (体体) )、细胞器、组织、细胞器、组织切片和微生物细胞等生物分子经固定切片和微生物细胞等生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的化后形成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力。物质有选择性的分子识别能力。 换能器换能器(Transducer)(Transducer) 将识别元件上进行的生化反应中将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光消耗或生成的化学物质，或产生的光或热

29、等转换为电信号，并呈现一定的或热等转换为电信号，并呈现一定的比例关系比例关系。酶传感器工作原理示意图酶传感器工作原理示意图酶传感器酶传感器主要由主要由固定化酶膜和变换器固定化酶膜和变换器组成：组成：固定化酶膜：固定化酶膜：选择性地选择性地“识别识别”并催化被检测物质并催化被检测物质发生化学反应；发生化学反应；变换器：变换器：把催化反应中底物或产物的变量转换成电把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。信号，通过仪表显示出来。 2）酶传感器的应用）酶传感器的应用 水质监测水质监测 用化学法测定酚时，硫化物、油类等用化学法测定酚时，硫化物、油类等可干扰其测定。可干扰其测定。 从马铃薯中提纯、经吸附交联得到从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感的固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感器，可检测大多数酚类化合物器，可检测大多数酚类化合物。医疗方面医疗方面葡萄糖传感器和血糖测定仪葡萄糖传感器和血糖测定仪 用葡萄糖氧化酶（用葡萄糖氧化酶（glucose glucose oxidase,GODoxidase,GOD）制成葡萄糖传感器，）制成葡萄糖传感器，可测定血液中