基因功能的验证

1、第十三章第十三章 基因功能的验证基因功能的验证 一是通过一是通过增强其表达增强其表达，取得表达产物进行研究，取得表达产物进行研究， 增强其表达增强其表达因为不能反映基因产物的真实表达情况，而逐因为不能反映基因产物的真实表达情况，而逐渐被抛弃渐被抛弃 二是二是减弱减弱或者或者终止其表达终止其表达，观察整体功能的变化，进而推测相应，观察整体功能的变化，进而推测相应的基因功能的基因功能1 RNA干扰技术干扰技术 它是指它是指外源性外源性与与内源性内源性双链双链RNA触发编码区同源触发编码区同源mRNA 特异特异性的降解，而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水性的降解，而导致基因表达沉默的现

2、象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默平，又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing)。当当dsRNA导入细胞后，被一种导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别，切割成特异的核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA。 在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降低突变，在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降低突变，以确定其功能。以确定其功能。 由于由

3、于RNAi具有高度的序列专一性，可以特异地使特定具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默基因沉默，获得功能丧失或降低突变，因此获得功能丧失或降低突变，因此RNAi可以作为一种强有力的研究可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。工具，用于功能基因组的研究。 在功能基因组中的应用在功能基因组中的应用 构建重组载体构建重组载体 重组重组DNA转入受体转入受体 细胞核内细胞核内 筛选目的细胞筛选目的细胞 转基因动物模型的建立转基因动物模型的建立 DNA-Binding DomainBait ProteinPrey ProteinTranscription Activating Reg

4、ionReporter GeneDNA-Binding Site酵母双杂交技术酵母双杂交技术反式作用因子中的两个功能结构域反式作用因子中的两个功能结构域 DNA结合域结合域 转录激活结构域转录激活结构域 鉴定新的蛋白与蛋白相互作用 鉴定蛋白级联底物 鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响 在已知的相互作用中鉴定干扰蛋白质 (反向双杂交系统)酵母双杂交系统应用酵母双杂交系统应用利用酵母作为真核蛋白相互作用的模型 是一种在体外研究两种或多种蛋白质之间物理相互作用的方法拉下实验拉下实验 基因组是指一个细胞单倍型所含的全部遗传信息，即基因组是指一个细胞单倍型所含的全部遗传信息，即DNA或或RNA编码的编码的遗

5、传信息遗传信息 蛋白质组则是指一个细胞一生中表达的蛋白质总和蛋白质组则是指一个细胞一生中表达的蛋白质总和蛋白组学研究蛋白组学研究 蛋白质组学是研究蛋白质组的一个新的领域，主要研究蛋白质蛋白质组学是研究蛋白质组的一个新的领域，主要研究蛋白质的特性，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和的特性，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋蛋白质相互作用白质相互作用，在，在蛋白质水平上蛋白质水平上了解细胞的各项功能、各种生了解细胞的各项功能、各种生理生化过程及疾病的病理过程等理生化过程及疾病的病理过程等o 蛋白质双向电泳(two-dimensional eleclrophoresis，2-D

6、E)是一种方便、灵敏的蛋白质分离方法 第一相电泳根据蛋白质的不同等电点分离各种蛋白质，即等第一相电泳根据蛋白质的不同等电点分离各种蛋白质，即等电聚焦法电聚焦法(isoelectrie focusing IEF) 第二向电泳根据蛋白质的不同分子量进一步分离等电点相同第二向电泳根据蛋白质的不同分子量进一步分离等电点相同的蛋白质，即的蛋白质，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 双向凝胶电泳技术是目前蛋白质组研究的主要技术之一双向凝胶电泳技术是目前蛋白质组研究的主要技术之一, 双向电双向电泳根据等电点和分子量可一次性分离数千种蛋白质，经染色后泳根据等电点和分子量可一次性

7、分离数千种蛋白质，经染色后蛋白质再蛋白质再PAGE上可形成密度不同、分布不均的复杂点图谱。上可形成密度不同、分布不均的复杂点图谱。 如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何对图谱上的蛋白质如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何对图谱上的蛋白质点进行检测、定量、比较、分析和归类，挖掘有价值的蛋白质点进行检测、定量、比较、分析和归类，挖掘有价值的蛋白质点的信息是双向电泳分析软件所要解决的问题。点的信息是双向电泳分析软件所要解决的问题。差异点：蛋白质的分离与鉴定蛋白质的分离与鉴定 蛋白质经双向电泳分离及图像分析后，将蛋白质斑点胶块切下，用蛋白酶通常用胰蛋白酶)对蛋白质样品进行胶内酶解，获得肽片段1 RNA干扰技术干扰技术 它是指它是指外源性外源性与与内源性内源性双链双链RNA触发编码区同源触发编码区同源mRNA 特异特异性的降解，而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水性的降解，而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默平，又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing)。 构建重组载体构建重组载体 重组重组DNA转入受体转入受体 细胞核内细胞核内 筛选目的细胞筛选目的细胞 转基因动物模型的建立转基因动物模型的建立 构建重组载体构建重组载体 重组重组DN