基因工程制药新

1、第三节 基因工程制药生产的基本过程一、工具酶的分离纯化一、工具酶的分离纯化二、载体的分离纯化二、载体的分离纯化三、外源DNA和目的基因的分离和获得四、外源DNA与载体DNA的切割与连接五、宿主细胞的选择和基因导入操作六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点七、基因工程菌中试八、基因工程菌的扩增和发酵生产九、基因工程药物的分离和纯化技术十、变性蛋白的复性十一、基因工程药物的质量控制十二、基因工程药物的制造实例血红蛋白基因血红蛋白基因排列顺序血红蛋白的结构血红蛋白的运送氧气功能一、工具酶的分离纯化（一）基因工程制药所用到的工具酶（二）关于限制酶（三）关于连接酶（一）基因工程制药所用到的工具酶限制性内

2、切酶限制性内切酶 甲基化酶Klenow聚合酶聚合酶T4-DNA聚合酶聚合酶T4-多核苷酸激酶碱性磷酸酶核酸酶-S1核酸酶-Bal31绿豆核酸酶 核糖核酸酶人外切核酸酶DNA酶-1外切RNA酶-III外切RNA酶-VIDNA聚合酶聚合酶1 T4-DNA连接连接酶酶末端脱氧核苷酸转移酶T4-RNA连接酶连接酶逆转录酶 大肠杆菌大肠杆菌-DNA连接酶连接酶 （二）关于限制酶1、宿主限制现象2、限制酶的定义3、限制酶的特征4、限制酶的作用5、基因工程所用到的限制酶6、影响限制酶作用的因素1、宿主限制现象 病毒或噬菌体在病毒或噬菌体在宿主宿主A细胞中生长良好细胞中生长良好,但在但在宿主宿主B细胞中生长很

3、差细胞中生长很差,原因是它的原因是它的DNA受到宿主受到宿主B的限制的限制,这种现象是这种现象是宿主宿主控制性限制控制性限制 （restriction）与修饰）与修饰(modification) ,简称（简称（R/M体系）。体系）。 细菌的细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨体系类似于免疫系统，能辨别自身的别自身的DNA与外来的与外来的DNA，并能使后，并能使后者降解掉。者降解掉。 R/M体系：体系：是由两种酶活性配合完成的：是由两种酶活性配合完成的： 一种是修饰的甲基转移酶一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶另一种是核酸内切限制酶TGAN8TGCT ACTN8ACGA TGAN8T

4、GCT ACTN8ACGA ECOBECOB核酸酶核酸酶甲基化酶甲基化酶CH3CH3CH3CH3噬菌体来源序列宿主来源序列2、限制酶的定义 凡是能够识别和切割识别和切割DNA分子内特定核苷酸顺序的酶称为限制酶。限制酶分为三个类型：（1）型限制酶-由于其切点不固定，很难形成特异性的切割末端。（2）型限制酶型限制酶-是位点特异性酶，是基因工程理想理想的工具酶。（3）型限制酶-对DNA的识别与切割点不同，不产生特异性DNA片段。3、限制酶的特征 具有专一性的识别位点。 能够形成固定的核苷酸单链末端。 比较适合于进行DNA结构的分析和进行基因重组。4、限制酶的作用（1）进行DNA重组。（2）构建新载体

5、。（3）构建基因文库。（4）进行DNA序列分析。（5）制备DNA放射性探针。5、基因工程所用到的限制酶通常是型限制酶型限制酶，具体有以下几种。EcoR-IEcoR-IHind-IIIHind-IIIBamH-IBamH-IPst-IPst-I Sst-ISal-ISal-IAva-I Bcl-IBcl-IHind-IIHpa-IHpa-I Bgl-II Cla-IHae-IIIHha-IHinf-IHpa-IIMbo-ISma-IXba-IXba-I Xho-IXho-I6、影响限制酶作用的因素（1）DNA的纯度（2）DNA的甲基化程度（3）DNA的结构（4）反应的温度-最适温度为3737度度

6、（5）反应的缓冲体系-反应体系中通常含有MgCl2、NaCl、KCl、-巯基乙醇、二硫苏糖醇、牛血清白蛋白。它们具有激活酶、稳定酶的作用。（三）关于连接酶1、定义-凡是能够催化DNA片段5 5- -末端的磷酰基末端的磷酰基与3 3- -末端的羟基末端的羟基结合成磷酸二酯键磷酸二酯键的酶，称为连接酶。2、作用-主要用于（1）正常DNA的合成。（2）损伤DNA的修复。3、种类（1）DNA-连接酶-广泛存在于生物细胞之中，主要取自于大肠杆菌E.coli。（2）T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶-来自于经过T4-噬菌体感染的大肠杆菌E.coli。 （3 T4-RNA连接酶-催化单链DNA或RNA的5

7、磷酸与另一单链DNA或RNA的3羟基之间形成共价连接。二、基因工程载体的分离纯化（一）定义（二）基因工程载体的必备条件（三）基因工程载体的种类（一）定义 能够将目的基因携带携带进宿主细胞、并可使得目的基因能够在宿主体内进行自主性自主性复制复制的遗传因子，称为基因工程载体。（二）基因工程载体的必备条件 （1）具有有效运载运载能力。（2）载体自身能够独立复制独立复制，并且在宿主体内进 行自主性复制。（3）载体在携带目的基因之后，还能够在宿主体内进行自主性复制自主性复制。（4）在宿主体内，能够控制外源基因的表达活动。（5）能够携带大小不同的外源性目的基因。（6）鉴定方便、装卸技术简单。（7）容易控制

8、、安全可靠。 （8）应具有灵活的克隆位点克隆位点、并且有方便的筛选标记筛选标记。（9）应具有很强的启动子启动子。（10）应具有阻遏子阻遏子，使启动子受到控制，因为外源基因的高效表达会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免受这种影响。（11）应具有很强的终止子终止子，以便重点克隆外源基因区段，而不转录其它无关基因。（12）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即含有起始密码AUGAUG和和SDSD序列，以便转录之后能够顺利于进行翻译。（三）基因工程载体的种类1、细菌质粒2、真核基因病毒DNA3、噬菌体DNA4、单链DNA噬菌体M13载体5、人工质粒载体-科斯质粒6、酵母人工染色体7、

9、其他载体1、细菌质粒（1）质粒的定义（2）质粒的特性（3）质粒的分类（4）质粒载体的具备条件（5）常用的细菌质粒（1）质粒的定义质粒载体质粒载体(plasmid)（2）质粒的特性 独立于细菌染色体之外的独立于细菌染色体之外的环状环状DNADNA或或RNARNA。 其遗传特性属于其遗传特性属于非染色体控制非染色体控制。 能够进行能够进行自我复制自我复制。 容易在宿主体内进行容易在宿主体内进行转移和迁移转移和迁移。 可编码宿主染色体所不具有的基因。能够赋予可编码宿主染色体所不具有的基因。能够赋予宿主额外的遗传特性：宿主额外的遗传特性：A A、编码产生、编码产生抗生素酶抗生素酶的抗性基因，的抗性基因

10、，B B、编码产生、编码产生糖酵解酶系糖酵解酶系的基因，的基因，C C、编码产生、编码产生抗重金属酶抗重金属酶的抗性基因。的抗性基因。质粒的复制类型质粒的复制类型严谨型（严谨型（strigent plasmid)：复制与宿主染色体同步受宿主复制与宿主染色体同步受宿主染色体复制的限制，在宿主细胞中染色体复制的限制，在宿主细胞中拷贝数低约拷贝数低约份拷贝份拷贝。松弛型（松弛型（relaxed plasmid):复制不受宿主染色体复制的复制不受宿主染色体复制的限制可独立复制，在宿主细胞中拷限制可独立复制，在宿主细胞中拷贝数高，宿主细胞中质粒有贝数高，宿主细胞中质粒有10-200拷贝拷贝。基因工程常用

11、载体基因工程常用载体。单链切割单链切割连接单链切割单链切割连接共价闭合环形DNADNA（SCSC型）开环DNADNA（ococ型）线性DNADNA（L L型）环形双链的质粒环形双链的质粒DNADNA分子具有三种不同构型分子具有三种不同构型（3）质粒的分类 F质粒-可使宿主A的部分基因随着F质粒一起转移到不存在该质粒的另一宿主B的体内。 R质粒-可编码宿主宿主A A的一种或者数种抗生素抗性基因，并能够将它们带到带到不存在该质粒的另一宿主宿主B B的体内，使得宿主B也获得同样的抗性。 Col质粒-能编码大肠杆菌毒素基因大肠杆菌毒素基因，通过表达之后产生的大肠杆菌毒素可以使得不带Col质粒的其它菌株

12、死亡。（4）质粒载体具备条件 质粒载体，也称质粒克隆载体，是指用于实现基因工程操作的质粒。必须具备以下条件：（1）其分子结构中必须具有多个单一限制酶的切割位点限制酶的切割位点。（2）构建重组质粒之后必须具有转化功能转化功能。（3）分子量较小，易于操作。（4）宿主范围较为单一、无感染性。（5）常用的细菌质粒pBR322pBH10pBH20pTR262pAT153pXf3Pmk16pGEM-3ZpUC19A、pBR322质粒质粒B、pUC19质粒质粒C、pGEM-3Z 质粒质粒pBR322:人工构建重要质粒人工构建重要质粒优点：具有较小的分子量优点：具有较小的分子量具有两种抗生素抗性基因，作为筛选

13、标记具有两种抗生素抗性基因，作为筛选标记具有高拷贝数具有高拷贝数是松弛型质粒是松弛型质粒pUC质粒优点：质粒优点：具有更小的分子，更高的拷数具有更小的分子，更高的拷数适于组织化学检测重组体适于组织化学检测重组体 含一个基因和一个laclacZ Z编码基因; ; 有多克隆位点（MCSMCS）; ; 正选择颜色标记 lacZlacZ; ; 有两个来自噬菌体的强启动子PT7和PSP6, ,用于外源基因的高效表达 注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等2743 bpMCSMCSlacZP

14、 PT7oriAprpGEM-3ZP PSP6SP62、真核基因病毒、真核基因病毒DNA（1）病毒载体的优点）病毒载体的优点（2）已经研究的真核基因病毒）已经研究的真核基因病毒DNA（1）病毒载体的优点A、具有很高的拷贝数量。B、有强大的启动子。C、可保证目的基因的高效表达。（2）已经研究的真核基因病毒DNAA、SV40SV40病毒病毒DNADNAB、牛乳头瘤病毒C、RNA病毒D、昆虫杆状病毒E、人痘病毒DNAF、猴空泡病毒DNAG、人腺病毒人腺病毒DNADNA H、人牛痘病毒DNA I 、逆转录病毒载体A、SV40病毒DNA（A1）、 SV40病毒DNA的特性（A2）、SV40病毒DNA的基

15、因组（A3）、SV40病毒DNA载体的构建（A4）、SV40病毒DNA载体的使用方法（A1）、SV40病毒DNA的特性为环状双螺旋环状双螺旋结构。其宿主为动物细胞。 SV40病毒有二种表达方式：（1）游离表达方式，SV40DNA+外源性DNA，形成重组DNA，进入宿主体内，以重组DNA的方式表达。（2）结合表达方式，重组DNA整合整合到宿主染色体的DNA之中，与染色体基因一起表达。（A2）、SV40病毒DNA的基因组（A3）、SV40病毒DNA载体的构建（A4）、SV40病毒DNA载体的使用方法G、腺病毒（G1）、腺病毒DNA载体（G2）、腺病毒DNA载体的特点3、噬菌体DNA（1） 噬菌体D

16、NA的特性（2） 噬菌体DNA的改造（3） 噬菌体DNA的体外包装（4） 噬菌体载体的构建（5） 噬菌体载体的使用（6） 噬菌体载体的优点（1）噬菌体DNA的特性噬菌体DNA为双链的双链的DNADNA病毒病毒，宿主是大肠杆菌。已发现噬菌体DNA可编码61个基因。A、噬菌体DNA在宿主体内的生活方式B、噬菌体DNA的结构A、噬菌体DNA在宿主体内的生活方式 （1）溶源方式）溶源方式：噬菌体DNA整合到大肠杆菌的DNA中，伴随大肠杆菌DNA的复制而复制，这种方式是噬菌体DNA作为基因工程载体的理论依据。 （2）溶菌方式）溶菌方式：噬菌体感染大肠杆菌后，终止了大肠杆菌染色体DNA所控制的遗传信息表达

17、，并进一步分解大肠杆菌DNA，最后导致大肠杆菌完全溶解。B、噬菌体DNA的结构噬菌体基因组噬菌体基因组基因组分为几个不连续的区域，三个片段组成：噬菌体基因组噬菌体基因组（2 2）噬菌体噬菌体DNADNA的改造的改造 野生型野生型噬菌体噬菌体DNADNA分子较大，其结构基因也很复杂，分子较大，其结构基因也很复杂，并且常常容纳不下分子量更大的外源性目的基因并且常常容纳不下分子量更大的外源性目的基因DNADNA片片段。需要对其进行改造。段。需要对其进行改造。 改造方法：改造方法： （1 1）遗传学方法遗传学方法-将将噬菌体噬菌体DNADNA交替地在不交替地在不含质粒的大肠杆菌、和含质粒的大肠杆菌的宿

18、主内生含质粒的大肠杆菌、和含质粒的大肠杆菌的宿主内生长，来删去其过多的限制酶位点。长，来删去其过多的限制酶位点。 （2 2）体外删除法体外删除法-将将噬菌体噬菌体DNADNA在体外进行在体外进行限制酶消化，再将未被切割部分经过蛋白质包装后，限制酶消化，再将未被切割部分经过蛋白质包装后，去感染大肠杆菌。经过几代连续培养之后，去感染大肠杆菌。经过几代连续培养之后，噬菌体噬菌体DNADNA就会失去不需要的限制酶位点。就会失去不需要的限制酶位点。（3）噬菌体DNA的体外包装A、体外包装的作用B、噬菌体DNA包装的原理C、噬菌体DNA的包装过程A、体外包装的作用 噬菌体噬菌体DNADNA连接上外源性目的

19、基因，就成为重组连接上外源性目的基因，就成为重组DNADNA分子，但分子，但是，重组之后的是，重组之后的DNADNA分子必须经过分子必须经过包装包装，加上，加上蛋白质外壳蛋白质外壳形成完形成完整的病毒颗粒，才具有整的病毒颗粒，才具有感染感染宿主的能力。宿主的能力。B、噬菌体DNA包装的原理 噬菌体DNA的头部蛋白头部蛋白+重组重组DNADNA分子分子+噬菌体DNA尾部蛋白尾部蛋白，在适当条件下混合，就能够自动地包装成完整的噬菌体病毒颗粒。（4）噬菌体载体的构建（A） 缩短长度（B） 改造酶切位点（C） 增加选择标记（A） 缩短长度插入型载体：失去了非必需区仅保留了EcoR的单一切点切点又位于报

20、告基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选可插入长度为10kb的外源DNA只含一个限制性位点可供插入外源DNA的载体，这类噬菌体载体称插入型载体。注意：噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能： 37kb 51kb。置换型载体置换型载体：可被外源置换型载体：可被外源DNA置换的置换的噬菌体非必噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点的载体，称为置需区两侧有一对限制性酶切位点的载体，称为置换型载体。换型载体。适用基因组克隆适用基因组克隆n特殊性质：中间区域约长18kb，这一段DNA可以被外源置换而不会影响phage裂解生长的能力。 包装限制： phage头

21、部外壳蛋白容纳DNA能力上限105%，下限75%。包装范围51kb, 36kb.只有DNA的长度大于野生型phage DNA长度的75而不超过其105时，才能被包装成phage颗粒，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时，phage活性就急剧下降，故要求载体DNA和外源DNA长度之和在3651kb之间。 载体必要区是28kb,理论上克隆能力为23kb.（B） 改造酶切位点野生型的-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 - 2个。为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。（C） 增加选择标记（5 5）噬菌体载体噬菌

22、体载体的使用的使用重组重组DNADNA的的构建构建 ( (酶切，酶切，连接）连接）噬菌体的噬菌体的体外包装体外包装噬菌体噬菌体侵染侵染大肠杆菌大肠杆菌重组重组DNADNA的的分离分离（6）噬菌体载体的优点噬菌体载体的优点容量大容量大，装载能力可达，装载能力可达23kb，便于构建基因文，便于构建基因文库库重组子筛选较为方便重组子筛选较为方便DNA提取操作较为简便提取操作较为简便4：单链：单链DNA噬菌体噬菌体M13载体载体 M13噬菌体（噬菌体（M13 phage）是一种大肠杆菌雄）是一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体，性特异丝状噬菌体，遗传物质是环状单链遗传物质是环状单链DNA,全全长约长约6.5

23、kb。宿主是宿主是丝状大肠杆菌丝状大肠杆菌。它是单链。它是单链DNA噬菌体中的一个典型的代表。噬菌体中的一个典型的代表。M13感染细菌感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制）。复制型型M13可用作克隆载体。可用作克隆载体。 噬菌体噬菌体M13感染宿主之后，在含有异丙基硫代感染宿主之后，在含有异丙基硫代半乳糖苷（半乳糖苷（IPTG）的）的X-gal培养基中生长时，会培养基中生长时，会形成蓝色噬斑。通过蓝色噬斑的出现可以显示噬形成蓝色噬斑。通过蓝色噬斑的出现可以显示噬菌体菌体M13的存在。的存在。 感染宿主之后，噬菌体感染宿主之后，噬菌体M13所释放的

24、单链所释放的单链DNA可可用于制作用于制作放射性标记探针放射性标记探针，用来检测，用来检测RNA的结构。的结构。M13噬菌体的组成和结构nM13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。M13噬菌体的组成和结构n单链DNA，由6407碱基组成。n90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因n基因间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因/以及基因/之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。M13噬菌体的基因组M13噬菌体的基因组n编码3类蛋白质：复制蛋白（基因，和）形态发生蛋白（基因，和）结构蛋白（基

25、因、和） M13 M13噬菌体载体的构建 M13M13噬菌体作为载体的重要特点：M13M13噬菌体的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢；M13M13噬菌体DNADNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将M13M13噬菌体DNADNA导人宿主菌中；M13M13噬菌体的包装不受DNADNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随DNADNA的大小而改变，即使DNADNA的大小比本身DNADNA的大小超出6 6倍，仍能进行包装。M13M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RF DNA：单链DNADNA的酶切和连接是比较困难的。外源片段插入位点在基因和基因之间的508

26、bp508bp间隔区-M13M13不像噬菌体基因组那样含有较大的可替代区。它的基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源DNADNA（基因/和基因/之间）。5 5：人工质粒载体：人工质粒载体-科斯质粒科斯质粒 1978 1978年年CollinsCollins和和HohnHohn构建一种新型的大肠杆菌克隆载体，命构建一种新型的大肠杆菌克隆载体，命名为名为cosmid(cosmid(柯斯质粒柯斯质粒) )，又叫，又叫粘粒粘粒。 柯斯质粒（柯斯质粒（cosmidcosmid）= cos= cos序列序列+ +质粒。质粒。 实际是质粒的衍生物，它是用正常的质粒同实际是质粒的衍生物，它是

27、用正常的质粒同噬菌体的噬菌体的coscos位位点构成。点构成。 AA、科斯质粒的基本组成、科斯质粒的基本组成BB、科斯质粒的特性、科斯质粒的特性CC、科斯质粒的用途、科斯质粒的用途Cos质粒（考斯质粒 Cosmid）A、科斯质粒的基本组成、科斯质粒的基本组成（1）含有）含有噬菌体噬菌体DNA的粘性末端序列（的粘性末端序列（COS序列）。序列）。（2）含有质粒的一个复制起始区。）含有质粒的一个复制起始区。（3）含有质粒的一个抗药性标记。）含有质粒的一个抗药性标记。（4）具有多种限制性内切酶的单一性切点。）具有多种限制性内切酶的单一性切点。B、科斯质粒的特性、科斯质粒的特性（1）分子量较小，由）分

28、子量较小，由4 kb-6 kb组成，装载量组成，装载量大（可达大（可达45kb) 。（2）重组之后能象）重组之后能象-DNA一样体外包装，并一样体外包装，并高高 效导入受体细胞。效导入受体细胞。（3）进入宿主细胞之后能够进行复制扩增。）进入宿主细胞之后能够进行复制扩增。可可 象质粒在大肠杆菌内复制象质粒在大肠杆菌内复制，（在细胞内，（在细胞内不能形成噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑）不能形成噬菌体颗粒，因而不能形成噬菌斑）不裂解细胞。不裂解细胞。（4）由于携带质粒的选择标记，便于筛选）由于携带质粒的选择标记，便于筛选 C C 、科斯质粒的用途、科斯质粒的用途常用的粘性粒有常用的粘性粒有PHC79

29、、PJB8、MUA-3和和KOSI等，它们大多具有一种或多种限制性等，它们大多具有一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。内切酶的单一酶切位点。用途：用途：构建基因文库。构建基因文库。克隆超大基因，如鼠的三氢叶酸还原酶，克隆超大基因，如鼠的三氢叶酸还原酶，40kb以上。以上。分析基因家族区段。分析基因家族区段。C2XB(6.6 kb)COSCOSSm B HCEAmpr COSpJB8(5.4 kb)PE B ECHSm ACOS质粒载体结构图 6：噬粒载体（：噬粒载体（phagemid） 1. 结构特点结构特点：在质粒载体中插入一段在质粒载体中插入一段M13或或fd的复制的复制起点，其插入方向

30、决定在噬菌体颗粒中形成正链还起点，其插入方向决定在噬菌体颗粒中形成正链还是负链是负链 2. 优点优点 .可以质粒方式复制，高拷贝存在于可以质粒方式复制，高拷贝存在于E.coli细胞中，便细胞中，便于大量提取质粒于大量提取质粒DNA用于用于DNA重组重组 .当有辅助噬菌体存在时（如当有辅助噬菌体存在时（如M13K07和和R408），噬），噬质粒重组质粒重组DNA分子将以分子将以f1复制起点开始进行复制，复制起点开始进行复制，形成单链形成单链DNA和噬菌体颗粒，形成的单链和噬菌体颗粒，形成的单链DNA可用可用于定序和特异位点突变于定序和特异位点突变T7AprF1 oripGEM-5Zf(-)(30

31、03 bp)orilacZMCSSp6T7AprF1 oripGEM-5Zf(-)(3003 bp)orilacZMCSSp6噬粒载体pGEMpGEM结构 7 7：酵母酵母人工染色体人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)（1 1）酵母人工染色体的必备元件）酵母人工染色体的必备元件（2 2）酵母）酵母人工染色体的结构人工染色体的结构（3 3）酵母人造染色体的使用）酵母人造染色体的使用（1 1）酵母人工染色体的必备元件）酵母人工染色体的必备元件复制起始位点复制起始位点着丝粒：与有丝分裂时染色体在子细胞中的分配有关。着丝粒：与有丝分裂时染色体在子细胞中的分配有关。端粒：与末端复制有关，起保护作用。端粒：与末端复制有关，起保护作用。（2）酵母人工染色体的结构（3）酵母人造染色体的使用8 8： 其他载体其他载体细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)动物细胞载体动物细胞载体