动物细胞基因工程技术

1、 具有复杂的翻译后加工系统 糖基化以及二硫键在合成和分泌过 程中自然而然的正确形成 产生正确折叠和完全生物活性的蛋 白质 瞬时表达 稳定表达动物细胞基因表达系统瞬时基因表达系统是一个简单、有效的外源蛋白表达手段，其表达水平最高可以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由未整合的、不复制的质粒DNA产生的，这样使得蛋白质表达的时间相对短，只有48h到7天。稳定表达系统需要得到稳定转化的细胞株，需要12个月的时间，在稳定转化的细胞中，DNA被整合到染色体中，这使得重组蛋白质产物可以一代接一代地产生。哺乳动物细胞表达系统与特征表达的蛋白质能正确加工、修饰并折叠；糖基化等修饰能保证糖蛋白行使功能；表达产物分泌

2、到培养液，容易分离纯化。u细胞生长缓慢，生产效率较低；u连续细胞系导致了副产物的增加；u对培养条件要求苛刻和敏感；u可能有潜在的致病因子、免疫原性存在；u表达载体的改进和宿主细胞的改造较为复杂。动物细胞表达系统与特征昆虫细胞表达系统与特征安全：杆状病毒无致病性，安全性受FDAFDA认可。易饲养：饲养，发育快。高量表达：用强启动子，外源基因可超量表达。高效表达：可容纳较大的外源基因（12kb12kb）翻译后的加工使大部分产物显示出良好的活性。u重组率低，筛选困难，周期长。u外源基因的表达在转染的晚期，这对表达不利。u糖基化等加工途径与哺乳动物细胞不完全相同构建高效表达载体：病毒载体，质粒载体转染

3、动物细胞：人源细胞株系，哺乳动物细胞株系，昆虫细胞株系筛选鉴定：选择剂，报告基因获得生产用工程化细胞系 基因工程动物细胞系的构建 质粒穿梭载体质粒的转染方法1. 磷酸钙共沉淀法2. DEAE-Dextran法3. 脂质体转染法4. 电穿孔法5. 基因枪法6. 超声波法7. 受体介导法1. 磷酸钙共沉淀法 把供体DNA溶解在HEPES溶液中，然后缓慢加入Na2HPO4-CaCl2溶液，供体DNA便被包裹在磷酸钙溶液中，这种共沉淀可被细胞吞噬，外源基因便导入了受体细胞。2. DEAE-Dextran法 将DNA溶液溶解在TBS含Tris、K、Na等缓冲液中，与二乙胺乙基葡萄糖（DEAE-Dextr

4、an）混合，滴加到受体细胞表面，供体DNA便会进入受体细胞。3. 脂质体转染法 脂质体是由磷脂、胆固醇或其它脂类形成的一种可以高效包装DNADNA的人造单层膜。其结构和性质与细胞膜极为相似，因而二者易于融合，DNADNA则由于细胞的内吞作用而进入细胞。 脂质体+无抗、无血清1640质粒+无抗、无血清1640孵育20min与细胞（4-6105/ml）混合+无抗、有血清16404-6小时补充正常培养基、24小时加G4184. 电穿孔法（electroporation） 将供体DNA与受体细胞混匀，在高压电场作用下，给细胞一个电脉冲，引起受体细胞出现瞬间可逆性开启，外源DNA便乘机通过膜孔进入细胞。

5、5. 基因枪法 将DNA与对人类无明显毒副作用而对DNA有良好吸附能力的微细金粒结合，在高压电场的作用下，金粒以极高的速度带入人体外的细胞内或直接带入人体内。 6. 超声波法 超声波可对细胞膜直接作用，使细胞膜的通透性增高，DNA DNA 可通过扩散作用进入细胞。本法对于悬浮和贴壁生长的细胞均适用，并且超声波可通过培养瓶瓶壁发挥作用。7. 受体介导法 此方法依赖于受体和配体间的特异结合所介导的细胞内吞作用而将外源基因导入细胞。一般是将DNA与多聚物（如多聚赖氨酸）结合而浓缩，再结合以一定的配体即可用于基因转移。不过效果仍不理想。 病毒载体1.反转录病毒 反转录病毒被认为是实现基因治疗最有希望的

6、载体之一，其主要优点是：基因转移的效率高，细胞宿主范围较广泛，DNA整合效率高于其它病毒载体。AV比较安全，它进入细胞后不能整合到染色体上，因此没有激活原癌基因和使功能基因失活的危险。AV不需要宿主细胞的分裂增殖就能进入细胞，这一特性允许它可在分化的以及有最低分裂能力的细胞中进行感染并使转基因得以表达。 AV载体的缺点是其免疫原性较强，易受机体免疫系统的中和作用而失活，不能整合到宿主细胞基因组也使得外源基因表达持续的时间很有限，AV载体插入外源DNA的能力也有限（7kb）。 2. 腺病毒AAVAAV的一个重要特性是其基因组整合到人基因组中时具有高度特异性，在人染色体19q13.4-ter19q

7、13.4-ter部位有一个单一的整合位点。可以说AAVAAV具有AVAV基因转移的高效性和RTVRTV基因表达的持续性，而且减少了RTVRTV随机整合可能导致的危险。 AAVAAV的缺点是其转基因的装载能力有限。完全的病毒基因组仅有4.7 kb DNA4.7 kb DNA， 插入外源DNADNA的长度自然也非常有限。3. 3. 腺病毒相关病毒 HSV是嗜神经组织的，有把基因转移到中枢神经系统的潜能 HSV基因组是长152kb的双股DNA分子。病毒融合到神经元的膜上并被转运到核。复制周期由潜伏期和裂解期组成。在潜伏期，病毒基因组被压缩并且至少两个潜伏相关的启动子被活化。在裂解期，病毒被复制并产生

8、病毒粒子。 HSV载体不能整合到宿主细胞基因组，因此表达持续的时间有一定限度。4. 单显性疱疹病毒 痘病毒在人类历史上已经广泛应用，因此使用痘病毒做为基因转移载体的安全性是勿容置疑的。痘病毒基因组DNA长达186 kb, 推测外源基因的容量可达30kb。痘病毒可感染非分裂的细胞，因此可适用的细胞型比较广泛。 其缺点是不能整合入细胞基因组，故外源基因表达的时间不能持久，载体过大，受免疫系统的影响也较大。5. 痘病毒质粒的转染方法1. 磷酸钙共沉淀法2. DEAE-Dextran法3. 脂质体转染法4. 电穿孔法5. 基因枪法6. 超声波法7. 受体介导法6. 超声波法 超声波可对细胞膜直接作用，

9、使细胞膜的通透性增高，DNA DNA 可通过扩散作用进入细胞。本法对于悬浮和贴壁生长的细胞均适用，并且超声波可通过培养瓶瓶壁发挥作用。AV比较安全，它进入细胞后不能整合到染色体上，因此没有激活原癌基因和使功能基因失活的危险。AV不需要宿主细胞的分裂增殖就能进入细胞，这一特性允许它可在分化的以及有最低分裂能力的细胞中进行感染并使转基因得以表达。 AV载体的缺点是其免疫原性较强，易受机体免疫系统的中和作用而失活，不能整合到宿主细胞基因组也使得外源基因表达持续的时间很有限，AV载体插入外源DNA的能力也有限（7kb）。 2. 腺病毒AAVAAV的一个重要特性是其基因组整合到人基因组中时具有高度特异性，在人染色体19q13.4-ter19q13.4-ter部位有一个单一的整合位点。可以说AAVA