胰蛋白酶活性测定

1、实验一胰蛋日酶活性测定实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD,主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE )水解为 H-苯甲酰-L-精氨酸(BA)。胰蛋白酶所催化的上述反响中， 产物 BA 对 253 nm的光吸收远大于 BAEE ,因此可以在实验起 始点把 253 nm的消光值调为零，然后记录反响体系对 253 nm的消光值的增量，并把这个增量 作为测定胰蛋白酶的活性指标。酶活单

2、位定义：在底物 BAEE 浓度 1m mol/L，光程 1 cm ,波长 253nm，温度 25C,测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001 (M/min=.1 )为 1 个 BAEE 酶活单位。胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般 E1%表达。这个值的含义是：浓度为 1%酶蛋白，在 1cm光径下，对紫外 280nm 的消光值。不同厂家、不同产品的 E1%值有很大差异。E1%值越高，说明酶制剂中酶蛋白含量越 高。由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的 E1%的测定值配制溶液。在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生

3、产的产品，生产公司对展品的描述是对280nm 紫外吸收值 15.3,配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。试剂： 标准胰蛋白酶，N-苯甲 酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。1.胰蛋白酶活性测定：1)配制 E1%的胰蛋白酶溶液每组取 E1%=15.3的 胰蛋白酶样品 10mg 放到 1ml 去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。BAEEon6H H IH 3 N )N Hl-r。I I+ C?HOH乙醇2按照表 1 的要求配制试验体系所需其它各种溶液3按照表 1 的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。表 1 胰蛋白酶活性测定加样顺序试

4、剂步骤 1:空白调零步骤 2:样品测定0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液,pH 8.0 ,2.0 m mol/L BAEE1.5 mL1.5 mL1.5 mL1.5 mL250C 预热 5min250C 预热 5min胰蛋白酶:10mg/mL蒸储水0L10L10L0L充分摇匀充分摇匀步骤1：.A253nm/min 步骤 2：.A253-nm/min调 0- 记录在步骤 2样品测定中，参加酶液后立即盖上盖迅速混匀计时，每半分钟读数一次，共读 34min。测得的结果要使253nm/min 控制在 0.050.100之间为宜，假设偏离此范围那么要适当增减酶量5PL-20 PL之间，空白试验

5、相应增减等体积水后重新测定，一直到A253nm/min 值落在 0.050.100 之间为止。3 分别求算：1标准胰蛋白酶溶液浓度10mg/mL的酶活和比活:计算方法：i胰蛋白酶活性单位数计算:ii胰蛋白酶比活计算：用 BAEE 单位数/mg 胰蛋白酶表示比活mg=昨妥言芋 1八 二Ms /- 六X稀暮倍数酶僵蛋白含量：tg械酶液参加体积徂Z腹黄白酶活力虫位曲EE单位就0一001酶液参加体积m/J稀释倍数膜蛋白酶比活力心单位实验二胰蛋日酶动力学测定实验目的：初步掌握以下几个酶动力学参数测定与求算方法：米氏常数 Km,最大反响速度 Vmax,转换数 Wcat，特异性常数 Kcat,/Km。实验原

6、理：胰蛋白酶遵守米氏方程，可以通过测定底物浓度与反响速度间的关系测定与求算这个酶的诸动力学参数。胰蛋白酶可以水解碱性氨基酸的短基所生成的肽键、酰胺建和酯键。在本实验中，利用胰蛋白酶水解酰胺键活性的性质，以苯甲酰-L-精氨酰-对硝基苯胺(BAPA)作底物测定这个酶的动力学参数，反响式如下:反响最适 pH8.1,最适温度 25 C反响产物之一：对硝基苯胺(p-Nitroaniline , 4 -NA)呈黄色，对 405nm 波长光的摩尔吸光系数为 9870,但底物 BAPA 和另一个产物 BA 对 405nm波长的光根本不吸收，因此本实验测定光波的波长设在405nm上，把起始反响的吸光值调为0,记

7、录消光值的变化。L-BAPA最大浓度低于 5xl04mol/L时这个酶促反响符合米氏方程，可用 Hanes 作图法求动力学参数。Hanes 作图法是单倒数作图法，把米氏方程变形为：在实验中设定一系列底物浓度Si,测定每一个底物浓度条件下的反响速度Vj,然后用Si/vi 对Si作图，可以得到一条线段，线段在y轴的截距是 Km/Vmax,线段的延长线在 x 轴的截距是-Km，据此可以得到Km和Vmax值；?cat=Vmax/ Et。Et是酶的初始浓度，已在实验设定为，因此 Rat 可以得出；特异性常数 Km/ Rat 可根据上述数计算出来。器材与试剂：器材：756紫外-可见分光光度计，恒温水浴锅，

8、分析天平，秒表，容量瓶，移液器。试剂:1.0.1mol/L pH8.1 的 Tris-HCI 缓冲液含 0.4%CaCl2：取 0.2mol/LTrisMr=121.14100mL 与 0.2mol/LHCI 52.4mL 混匀，参加 0.8gCaCl2,蒸储水定容到 200mLpH值需用计 pH校正。2.1mmol/L DL-BAPA Mr=434.9 水溶液：称取 43.49mg BAPA，蒸储水溶解并加热到800C以上，完全溶解后置冰水中冷却，定容到 100mL。这个浓度为 1mmol/L 的 DL-BAPA 溶液命名 为第六组母液，按照逐步稀释原那么配制以下溶液浓度系列：0.8m mo

9、l/L 第五组母液，25mL;0.6mmol/L25mL，第四组母液；0.4mmol/L25mL，第三组母液；0.2mmol/L10mL, 第二组母液 ；0.1 m mol/L 10mL,第一组母液。3.60% V/V乙酸溶液4.胰蛋白酶溶液，该酶的比活：1.0X104BAEE 单位/mg 蛋白实验步骤：1.计算胰蛋白酶加样体积：在本实验中参加胰蛋白酶的量是60Rg,实验 1 已经测到胰蛋白酶的比活和浓度Mg/ML，根据这些值计算参加体系的酶液体积的虬 数。2.实验溶液系统： 本实验有 6 组实验组成。实验顺序按照表2 的加样程序执行。表 2.测定 Km和 Vmax值加样表:BAPA参加BAP

10、A母液参加参加参加V母液浓度(mL)Tris-HCI胰蛋白酶60%乙酸BAPA浓度A405(m mol/L )(mL)(H)(mL)(m mol/L )1.0.1样品1,2.01.5n0.4S10.05对照1,2.01.600.420.2样品2,2.01.5n0.4S20.1对照2,2.01.600.430.4样品3,2.01.5n0.4S3 0.2对照3,2.01.600.440. 6样品4,2.01.5n0.4S40.3对照4,2.01.600.450.8样品5,2.01.5n0.4S50.4对照5,2.01.600.461 .0样品6,2.01.5n0.4S60.5对照6,2.01.60

11、0.425C 保温 5 min 后，摇匀，秒表计时，准确反响2min 后参加 0.4mL 60%的乙酸溶液，摇匀终止反响。反响溶液总量应到达4mL,缺乏局部可加蒸储水补足。对照试管不参加胰蛋白酶，只加入 0.4mL 60%的乙酸溶液。最后分别记录样品和对照的A405值，每组种两者的差值 A405代入下式即可得到对应于Si的 V表 2 列出的是 6个实验，鉴于目前实验室尚没有 12个枪头的加样，所以每一个实验都可独立进 行。需要特别注意：1 比活大于 1.0 乂 104BAEE u/mg protein 的胰蛋白酶制剂，纯度范围是90%-100% , 一般可达到 95%-97%。在计算动力学参数

12、时， 如无特殊精确要求， 可按照胰蛋白酶 100%的近似值计算。在本试验中，可根据浓度胰蛋白酶浓度10mg/ml,纯度 100%,每个试管要求参加质量数60Pg,计算出每个试管参加的胰蛋白酶溶液微升数。2 在进行动力学参数计算时，要进行胰蛋白酶质量-摩尔数转换，如无特殊要求，也可以把胰 蛋白酶纯度近似为 100%.3 如果有求精确，但产品说明没有给出胰蛋白酶在固形物中的百分含量，就需配制一定浓度的固形物溶液，首先测定蛋白质浓度，通过求算蛋白质总量，得到蛋白质在酶制剂中的重量比。然后通过双向电泳，图像扫描，把扫描结果输入计算软件，按照软件步骤，求算胰蛋白酶在全 部蛋白样品中的百分比。把实验设定的每一个Si和测定到的对应的 Vi 换算成Si/Vi后，填入表 3,作图求 Km Vmax表 3. Hanes 作图的数据Si/、.i:Si/.iS2/.2S3/.3S4/ .4 S5/.5S6/.6Si：SiS2S3S4S5S6用S/v 对S作图可得到一条线段，线段与轴的截距是 Km/Vmax ,线段延长线与 x 轴的截距是-Km,根据方程v( mmo