饮用菊花脱毒原种苗繁育技术规程(征求

1、ICS点击此处添加中国标准文献分类号DB地方标准DB 36/ 2021629饮用菊花脱毒原种苗繁育技术规程Technical regulations of breeding of chrysanthemum virus-free seed seedlings点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（本稿完成日期：2021年12月）XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施江西省市场监督管理局发布DBXX/ XXXXXXXXX目次前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14一般性要求25网室建造与隔离26原种苗生产3附录A6前言本标准按照GB/T 1.1-2020标准化

2、工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及本专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本标准由江西省农业农村厅提出并归口。本标准起草单位：江西省农业科学院蔬菜花卉研究所。本标准主要起草人：汤泳萍、罗绍春、叶艳英、张冰冰、周劲松、尹玉玲、程正新、谢启鑫。IIDBXX/ XXXXXXXXX饮用菊花脱毒原种苗繁育技术规程1 范围本标准规定了饮用菊花（Chrysanthemum morifolium (Ramat.) TzveL.）脱毒原种苗的繁育技术要求和规程。本标准适用于常见饮用菊花脱毒原种苗的生产。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可

3、少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19165-2003 日光温室和塑料大棚结构与性能要求GB/T8321 （所有部分）农药合理使用准则NY/T 1224-2006 农用塑料薄膜安全使用控制技术规范NY/T 391 -2021绿色食品 产地环境质量NY/T 496 -2021肥料合理使用准则 通则NY/T 1657-2008 花卉脱毒种苗生产技术规程NY/T 1591-2008 菊花切花种苗等级规格NY/T5121-2002 无公害食品饮用菊花生产技术规程NY/T525-2021 有机肥料3 术语和定

4、义下列术语和定义适用于本文件。3.1 饮用菊花脱毒种苗 （Drink chrysanthemum virus-free seedlings）指经RT-PCR检测方法鉴定，确认脱除了菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、黄瓜花叶病毒（CMV）等的脱毒核心材料（或脱毒苗）在隔离条件下生产的原原种苗、原种苗。 3.2 原原种苗 （breeder seed） 指经组织培养过程直接获得的种苗。3.3 原种苗 （foundation seed）是指原原种苗繁殖的第一代苗。4 一般性要求4.1 产地环境 产地环境符合 NY/T 391-2021的规定。4.2 场地要求 选择排灌方便，地下水位较低，土

5、层深厚、肥沃、疏松，3年内未种过茄科作物，中性或微酸性土壤地块种植。4.3 化学农药使用 应符合GB/T8321（所有部分）的要求。4.4 肥料要求 应符合NY/T496-2021和 NY/T525-2021的要求。5 网室建造与隔离一般宜南北向建造，钢架结构，大棚单体大棚宽8m，顶高不低于2.8m，连体棚可23联体，棚宽8m为宜，大棚肩高不低于1.5m，连体大棚宜在中间拱顶上分布避雨天窗散热。大棚长度可依据地形确定，最长不超过50m。大棚所有通风处安装60目防虫网。大棚搭建应符合GB 19165-2003要求，大棚覆盖薄膜应符合NY/T 1224-2006要求。大棚入口处宜配套缓冲间，田间操

6、作人员进入防虫温、网室应更换工作衣和鞋具。6 原种苗生产6.1 原原种苗生产6.1.1 材料和培养基准备选具有繁育品种典型性状、生长健壮的植株，至光照培养箱中采用变温升温的方式进行热处理，在日温/夜温分别为26 /20 下培养2d后，而后每2d昼/夜温度分别升高2 ，直至38 /30 ，该温度下培养40d，取高温培养长出的茎段，剪去叶片，留取心叶或腋芽，放在烧杯中，用肥皂水冲洗干净，再用自来水冲洗1h。滤干，移入无菌操作台，用20%的次氯酸钠灭菌8min10min，取出后用无菌水冲洗35次，待用。将制备好的MS+6-BA0.1mg/L培养基溶液分装于培养瓶，每瓶30ml，瓶口盖紧瓶盖。在121

7、 ，1.1 MPa条件下灭菌20min，冷却后放入无菌操作台待用。6.1.2 分化和继代培养在无菌条件下，在解剖镜下剥取已灭菌材料的生长点0.3mm0.5mm，接种到已灭菌的培养基上，置于26，光强2000lx3000lx，光照时间16h/d条件下培养，一周左右茎尖转绿并萌动，20d30d形成带芽茎段。在无菌条件下将已分化的带芽茎段剪成小段，每段带12个腋芽，转入培养基（MS+6-BA 0.1 mg/L）中进行增殖，34周后获3040个带腋芽芽段。6.1.3 病毒检测 取继代培养壮芽或叶片提取RNA，经RT-PCR检测方法鉴定，如没有病毒则继续培养，脱毒不彻底则弃之不用。具体操作见附录A。6.

8、1.4 生根培养及炼苗移栽6.1.4.1 生根培养将继代培养的茎段转入生根培养基（MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA0.1 mg/L）诱导生根，培养温度2526，34周后95%均生根。6.1.4.2 炼苗移栽瓶苗株高6cm7cm，56片平展叶，生根5条以上3cm4cm长的根时即可炼苗，幼苗炼苗1d2d后，定植在营养钵或苗床，于具60目防虫网的防虫网室或防虫温室内进行培育。6.1.4.3 移栽管理原原种苗采用9cm×9cm营养钵或苗床移栽，珍珠岩+蛭石+泥炭按体积比111的比例混合做基质，移栽前用广谱保护性杀菌剂喷洒消毒。移栽后浇透定根水，以后保持基质70%的持水量，空气湿度保持

9、在80%90%。太阳光强时要注意采用遮阳网遮荫。当植株发新叶后，逐步恢复自然光照，并进行叶面施肥。气温不足时采取小拱棚膜和大棚相结合的双膜覆盖方式。白天保持2526，夜间1820。成活后白天保持2527，夜间1618，注意控水降温，防止幼苗徒长。移栽前一周注意揭膜通风炼苗。6.2 脱毒原原种苗的性状观察 随机抽取每个无性系脱毒苗510株，以其母株为对照一起种植至开花。观察比较其主要生物性状，与母株无差异者则可确认为原原种苗，有差异则淘汰整个无性系。6.3 原种苗网室中繁殖6.3.1 原种繁育田环境原种繁育田要求育苗环境除应符合NY/T 391-2021的规定外，要选择排灌方便、地下水位较低，地

10、势高燥，土层深厚、肥沃、疏松，阳光充足，通风条件好，3年内未种过茄科植物，5年内未种过菊科植物的中性或微酸性土壤地块，且周围800m范围内无其它菊科和茄科植物种植。6.3.2 苗床整理、消毒育苗地于冬前深耕晒垡，每667m2施入完全腐熟的农家肥500kg，扦插前一周左右平整土地，清除杂草，畦面做到平、细、碎。育苗畦高25cm30cm，畦面宽100cm，畦间距40cm。苗床四周开宽50cm的深沟，便于排水。苗床消毒每平方米用70%甲基托布津可湿性粉剂8g兑水1000倍，菌线威0.3g0.5g兑水35007000倍，均匀喷洒畦面上预防杂菌和根结线虫病。再用茶枯饼0.03 kg驱赶地下害虫。在整平的

11、畦面上均匀铺上5cm10cm厚的河沙。6.3.3 定植、剪顶、腋芽扦插原种苗母株定植行株距应为45cm×45cm，便于除草和施基肥。从炼苗移栽成活的原原种苗上取健壮枝条扦插于苗床上，于网室中扩繁。当原种苗母株长到78片叶时，从基部留34片叶处剪下顶芽进行扦插。6.3.4 原种苗越冬和田间管理在原种基地扩繁种苗需周年进行，当温度低于0时，需要搭小拱棚，盖上薄膜保温。当母株苗越冬后，要及时掀开薄膜，中耕除草，松土保墒。苗高7cm8cm时，要开沟施1次复合肥。施用肥料应符合 NY/T 496-2021 和 NY 525-2021 规定。具体田间管理参照NY/T 1657-2008和NY/T

12、5121-2002操作，经过一年生产和集中繁育，繁育出健壮原种苗。6.4 脱毒原种苗质量检测脱毒原种苗质量检测参照NY/T 1591-2008中5.1.3进行抽样检查，并按照NY/T 1591-2008中5.2的内容进行检测，确定种苗的质量等级。附录A（规范性附录）RNA病毒的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法A.1主要仪器设备与试剂、耗材表1 各步骤主要仪器设备与试剂、耗材步骤/类别主要仪器设备主要试剂盒与试剂（试剂均使用分析纯试剂）主要耗材RNA提取高压灭菌锅、电子天平、高速冷冻离心机、微量移液器、微量核酸测定仪RNA提取试剂盒：TaKaRa MiniBEST Plant RNA

13、 Extraction Kit试剂：无水乙醇、液氮无RNA酶的离心管（1.5mL， 2mL）、移液器配套枪头、配套枪头盒、研钵、研棒、PE手套、乳胶手套第一链cDNA合成水浴锅、制冰机、PCR扩增仪器反转录试剂盒：PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit无RNA酶PCR管和枪头、乳胶手套PCR扩增PCR扩增仪器、制冰机微量移液器、微量离心机Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye) 、引物、矿物油无RNA酶PCR管和枪头、乳胶手套凝胶电泳电子天平、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统琼脂糖、1&#

14、215; TAE缓冲液、 DNA Marker三角瓶、量筒、制胶板、梳子、乳胶手套A.2 操作步骤A.2.1 菊花总RNA的提取RNA提取按照试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit）Protocol-II的说明书 进行。用1.0%的琼脂糖凝胶对总RNA提取结果进行电泳检测，利用微量核酸测定仪检测RNA浓度，测量A260与A280值。A.2.2 第一链cDNA合成按照反转录试剂盒（PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）说明书进行。A.2.3 PCR扩增及电泳（1）PCR 反应体系PCR反应体系：

15、 总体积10L，其中0.4L上游引物（ 10mM）， 0.4L下游引物（ 10mM）， 5L Premix Taq (TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)（0.05U/l）， 1LcDNA模板（ 20ng/L），3.2Ldd H2O。（2）PCR反应程序PCR反应程序：1）94 预变性4min；2）94 变性45s；3）按表A.4 推荐的引物退火温度退火45s；4）72 延伸45s；5） 重复步骤2）4），共35个循环；6）72延伸7min；7）4 保存。（3）PCR扩增产物电泳检测配制1.0%琼脂糖凝胶，放入电泳槽中，电泳液浸没胶面1mm。样品沿着胶孔边缘匀速加入

16、。接通电源，选择合适的电压和时间电泳。电泳结束后，胶块置于紫外成像系统中，调整拍摄范围和焦距，拍摄成像。A.3 结果判断RT-PCR检测时，设定阳性和阴性对照，当阳性对照有目标带出现，阴性对照无带时，检测的结果为有效。检测样品有与阳性对照相同的目标带出现时为阳性，无目标带为阴性。表2 菊花病毒的特异性引物病毒名称引物序列（5-3）退火温度产物（bp）菊花B病毒（CVB）P1:ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCCP2:TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCGG55650番茄不孕病毒（TAV）P1:CCATCCCTTCAACATCCGACTTP2:GGAGCGTTGA

17、AGCGGAAGGAAT52499黄瓜花叶病毒（CMV）P1:GTAGTGAACGATGTAAACCTGGGP2:GCAGGAACTTTACGAACTGTCAC59210番茄斑萎病毒（TSWV）P1:CTCTGGTGTCATACTTCTTTGGGP2:GGCTTGTAGAGGAAACTGGGAAT58264菊花矮化类病毒（CSVd）P1:ACTCCTGACCCTGCTGCTTP2:AAGGTTCCACGGGCTTACT50313饮用菊花脱毒原种苗繁育技术规程江西省地方标准编制说明一、工作简况（一）任务来源 2021年11月22日，由江西省农业科学院蔬菜花卉研究所申请地方标准的立项，根据江西省市

18、场监督管理局下达的2021年度第六批江西省地方标准制修订项目计划，批准饮用菊花脱毒原种苗繁育技术规程地方标准的制定。计划项目编号为：DB36-2021-6-29。（二）起草单位起草单位：江西省农业科学院蔬菜花卉研究所（三）主要起草人姓 名性别职务/职称工作单位任务分工汤泳萍女研究员江西省农业科学院蔬菜花卉研究所负责标准技术总体方案的制订、试验设计罗绍春男研究员江西省农业科学院蔬菜花卉研究所方案实施、文本起草叶艳英女助理研究员江西省农业科学院蔬菜花卉研究所方案实施、文本起草张冰冰男实习研究员江西省农业科学院蔬菜花卉研究所方案实施、文本修改周劲松男研究员江西省农业科学院蔬菜花卉研究所方案实施、文本

19、起草尹玉玲女副研究员江西省农业科学院蔬菜花卉研究所方案实施、文本修改程正新男副研究员江西省农业科学院方案实施、文本修改谢启鑫男副研究员江西省农业科学院方案实施、文本修改二、制定（修订）标准的必要性和意义菊花( Chrysanthemum morifolium (Ramat.) TzveL.) 起源于中国，为菊科菊属多年生宿根草本植物。是我国的传统名花，除观赏外还有较高的饮用、食用、保健等价值。我国栽培菊花历史悠久，特别是近几年来，饮用菊花产量高，种植效益好，我国饮用菊花生产有了长足的进步，原有的主产区对饮用菊花的重视程度得到提高，种植面积不断扩大，一些原本非饮用菊花主产区也积极发展，

20、从而形成了新的主产区，至2019年仅江西婺源饮用皇菊种植面积已经超过4000余亩 。2017年修水县饮用金丝皇菊种植面积达1.8万亩，干花产量约900吨，菊花综合产值4.5亿。江西是我国饮用皇菊的主要产区之一，出产的皇菊品质优良，在国内外享有盛誉，近几年来也发展迅速。但是，一直以来，江西饮用菊花传统繁育种苗及常规栽培技术存在着菊花品质下降、花朵畸形、品相不好等，从而总体种植效益低。生产出的产品外形不饱满，菊花产品商品性差的问题。这些问题严重制约了江西菊花产业发展。如何解决这些问题，江西省农业科学院蔬菜花卉研究所在广泛调研的基础上，在江西省休闲农业体系农艺岗江西省重点研发计划（20202BBFL

21、63008）和江西省现代农业科研协同创新专项课题（JXXTCX201904-03）等项目的大力支持下，充分发挥自身科研优势，研究总结和提出了“饮用菊花原种苗繁育技术规程”。这项技术的推广应用将利于大幅度降低饮用菊花种苗繁殖过程中的劳动强度、大幅度提高饮用菊花种苗质量和菊花产品品质，有效提高饮用菊花种植效益，这对促进江西饮用菊花产业健康可持续发展，保障我国饮用菊花安全和促进种植业结构调整、农业增效、农民增收和农村发展具有重要的现实意义。三、 主要起草过程（一）成立了饮用菊花脱毒原种苗繁育技术规程标准编写小组，由汤泳萍研究员任组长，罗绍春、叶艳英、张冰冰、周劲松、尹玉玲、程正新、谢启鑫等为成员。

22、（二）查阅了大量文献资料。查阅了相关国家标准、行业标准和涉及饮用菊花质量标准、农药的安全使用、种苗产地检疫、病虫草害防治等有关资料； （三）反复试验。我们进行了大量茎尖提纯复壮、原种苗移栽和扩繁，生产上应用开花效果等多次繁育原种苗和栽培试验，以确定最佳原种苗繁育、移栽扩繁和配套栽培技术等。（四）虚心请教，集众人智慧之大成。在该规程的编制过程中，曾向多位植保专家请教治病、防虫、除草技术，向肥料专家请教如何合理施肥等肥水运筹技术。在实践基础上，经历反复验证和修改，并征询多位专家及各地有实践经验的技术人员的意见完成修改稿。 四、制定（修订）标准的原则和依据，与现行法律、法规、标准的关系编制遵循&qu

23、ot;先进性、实用性、统一性"的原则，尽可能与国内外领先标准接轨，注重了标准的可操作性，严格按 GB/T 1.1-2020的最新版本标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则的要求进行编写。 本标准所涉及的品种选择、材料准备、取材长度、配套大棚和防虫网选用、土壤条件、畦宽沟宽、病虫害防控等技术环节时，查阅了菊花相关国家标准和行业标准，并广泛查阅了菊花栽培的最新研究进展。按照NY/T 1657-2008花卉脱毒种苗生产技术规程.香石竹、菊花、兰花、补血草、满天星、NY/T5121-2002无公害食品饮用菊花生产技术规程、GB/T8321（所有部分）农药合理使用准则等国家及行业标准及国

24、家关于饮用菊花产品生产安全要求，以“降低饮用菊花用肥用药、降低生产成本、提高生产效率和产品品质”为主要目标，既考虑到江西省饮用菊花生产的现状，又兼顾了国内外菊花栽培技术的发展趋势。五、主要条款的说明 2015年的栽培试验结果显示，受昆虫传播病毒的影响，传统菊花扦插育苗方式无法阻隔病毒病，导致菊花的花朵有30%以上发生畸变或残缺。江西省农科院蔬菜花卉研究所起草团队通过多年反复取材、培养和创新栽培试验，终于建立了黄菊组培脱毒和原种繁育技术体系，解决了黄菊种苗提纯复壮的技术难题，使黄菊花朵的残缺率从30%以上降低到4%左右。为更好的指导生产实际，特形成本技术规程。本技术规程确定的“饮用菊花脱毒原种苗

25、繁育技术”繁殖的原原种苗和原种苗在新建区南昌和博生态农业有限公司、鄱阳县毛山皇菊专业种植合作社、高安西苑实业有限公司种植基地、德兴楼上楼等多点进行了试验、示范，种苗繁育及配套生产技术已成熟。1. 范围。本标准规定了饮用菊花脱毒原种苗繁育技术要求、有关术语和定义、产地环境、化学农药和肥料要求、网室建造与隔离、原原种苗生产、材料和培养基准备、分化和继代培养、病毒检测、生根培养和炼苗移栽、移栽管理、原种苗生产、苗床整理与消毒、定植、剪顶、腋芽扦插、原种苗越冬和田间管理、原种苗质量检测等管理技术措施。本标准适用于江西省常用饮用菊花脱毒原种苗的繁育。2. 术语。参考了现行的我省及国内有关文献资料，本技术规程采用的术语规范、明确。3. 饮用菊花脱毒原种苗繁育技术规程的确立。本规程得到江西省休闲农业产业农艺岗项目、江西省重点