SSR分子标记在甘蔗遗传育种中的研究现状

1、主要内容1、SSR标记技术的原理和特点2、SSR标记技术的技术要点3、SSR标记技术在育种中的应用4、SSR标记技术未来发展分子标记背景 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式，它以蛋白质、核酸分子的突变为基础，检测生物遗传结构及其变异。 目前广泛应用的 DNA 分子标记有三代，分别为第一代的限制性片段长度多态性(RFLP)，随机扩增多态性DNA (RAPD)，第二代的扩增酶切片段长度多态性(AFLP)，简单序列重复长度多态性(SSR)，第三代的单核苷酸多态性(SNP)等。 由于 SSR 标记具有共显性、技术简单、多态性丰富等特点，使得 SSR 标记在

2、分析遗传多样性和构建品质指纹图谱与品种鉴定方面有着极高的效率，因而ssr被广泛运用于农业育种等方面。SSR的概念 SSR(Simple sequenc repeat)标记即简单序列重复。具体一点就是简单的核苷酸序列的重复。在DNA中主要以 25 个核苷酸为重复单位，如(GA)n、(AC)n、(GAA)n 等，这个n一般为10-50. 由于重复次数n的不同，SSR 序列就有不同的长度，这就构成了它的多态性。因此 SSR 序列非常适合区分各种有亲缘关系的物种基因型。 SSR 序列广泛分布在几乎所有真核细胞生物及少数原核细胞生物的基因组中，SSR 序列的分布是随机的，大约每隔 10000-50000

3、 个碱基对，就有 1 个 SSR 序列。SSR标记技术的原理 同一类 SSR 可分布在基因组的不同位置上。由于 SSR 中的重复单位数目是高度变异的，且 SSR 两端的序列一般是相对保守的单拷贝序列，因而根据其两端的序列可设计一对互补序列的寡聚核苷酸引物，通过 PCR 扩增产生重复序列长度多态性。GAGAGAGAGAGAGAGAGAGA GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAABCABCSSR标记技术的特点 与其他分子标记（AFLP、RAPD、RFLP 等）相比，SSR 标记具有以下优点： 多态性高。 具有多等位基因的特性，其 PCR 产物在进行测序胶电泳分离时具有单碱基高分辨率，遗传信息量

4、大。 每个位点由设计的引物顺序决定，便于合作交流开发引物。 由于 SSR 多态性仅由简单序列的重复次数的差异起，通常为共显性标记，呈孟德尔方式遗传，具有很好的稳定性，因而对个体鉴定具有特殊意义。 仅需微量组织，DNA用量少，即使 DNA 降解也能有效地分析鉴定。 技术要求低，易于实现自动化。 然而 SSR 标记技术也有其缺陷： 主要在于 SSR 座位突变率高，对变异反应非常敏感，所以易受到趋同变异引起的平行演化程度的影响，从而给物种间亲缘关系的评估带来误差。 同时 SSR 是必须针对每个染色体座位测定并找到 SSR 两端寡聚核苷酸来设计引物，较费时耗力。SSR标记技术的技术要点 SSR 标记技

5、术的核心技术是引物的设计、PCR 扩增、凝胶电泳分析。 目前，被用于 SSR 标记引物设计的方法主要有文库法、富集法、近缘物种间共用引物法、生物信息学法等。 文库法是经典的 SSR 引物设计方法，其过程为： 首先建一个基因组文库 提取基因组 DNA 限制性内切酶或超声波处理获得 DNA 片段 将 DNA 片段接入噬菌体或质粒中 用放射性同位素或地高辛标记的含有 SSR 序列的寡聚核苷酸探针筛选文库 对筛选出的阳性克隆测序 选择序列较长且 SSR 序列位点偏向序列中部的 SSR 序列两端的侧翼序列设计引物（一般为 2025 个碱基对）。 引物的设计 富集法是由文库法改进而来的。 首先建一个小插入

6、片段基因组文库，再使用含重复序列的寡核苷酸引物或探针对该基因组文库进行富集筛选，使用筛选出的阳性克隆构建一个富集文库。 而后的基因文库筛选、阳性克隆测序和引物设计过程与文库法的一致。 近缘物种间共用引物法是指研究者可以使用与目标物种具有较近亲缘关系的其他物种（同科不同属或同属） 的 SSR 序列引物来设计 SSR 标记引物或直接进行 SSR 分子标记的方法。 生物信息学法是指研究者使用 SSR 序列搜索软件在基因组数据库或报道文献中搜索相关的基因序列和表达序列标签（EST）序列， 从而获得 SSR 序列信息来设计所需的引物。PCR扩增 SSR 扩增虽然重复性和稳定性相对较好，但对于不同的引物对

7、，其 G+C 的含量不同和扩增片段长度不同，不同物种的 DNA 扩增条件存在差异，其退火温度就要做适时的调整，同时也要通过对药品体系浓度、热循环程序次数等反应参数的调整来获得清晰可靠、方便统计分析的条带。增产物的分离和检测SSR标记技术在育种中的应用遗传连锁图谱构建2分子标记辅助育种4亲缘关系和遗传多样性的研究3 1DNA 指纹和品种鉴定3 3亲缘关系和遗传多样性的研究 由于 SSR 标记技术具有实验结果重复性好和等位基因多态性丰富的特点，因此该方法非常适合对农作物品种资源的遗传多样性进行分析。通过确定农作物品种资源间的遗传距离，建立遗传关系谱系，育种者可以进行育种研究。 李丽华等利用 SSR

8、 分子标记对 135 个西南地区玉米自交系的遗传多样性进行了研究，结果表明大部分自交系可以被划分为几个类群，少数四川和云南材料可形成单独的类群。 遗传连锁图谱构建 遗传图谱（连锁图谱）是以具有遗传多态性的遗传标记为路标，以遗传学距离为图距的基因组图。 它显示了一个物种已知基因及遗传标记在其染色体上的相对位置，为基因的识别、定位、分离和研究提供了物质基础。 研究者利用 SSR 标记共显性遗传、多态性高、重复性好的特点，将其作为锚定标记在遗传图谱构建中使用，这有助于归并和整合具有相同遗传背景的遗传图谱。 DNA 指纹和品种鉴定 在育种中，骨干亲本系的重复利用和农作物种质资源的缺乏加大了新育成品种的

9、鉴定、审定和管理难度。 由于缺乏便捷有效的识别手段， 假冒伪劣种子（苗）屡禁不止。 此外，国际植物新品种保护联盟已将DNA 分子标记鉴定纳入农作物品种的植物新品种测试内容。 因此，尽快建立农作物新品种标准化“身份证”-DNA 指纹图谱库-对农作物品种鉴定审定、品种注册、种子生产销售管理以及保护育种者知识产权具有重要意义。 高运来筛选出 9 对 SSR 引物，将黑龙江 13 个育种单位 6 个积温带的 83 份大豆品种完全区分开，构建了黑龙江省大豆品种的分子身份证。分子标记辅助育种 利用与目的基因紧密连锁的分子标记，育种者可以对育种材料及其杂交后代进行前景选择和背景选择，并通过回交等常规育种技术

10、手段将目的基因整合到新组合中，从而选育出优良品种。 该技术的关键是识别出与目标农艺性状紧密连锁的分子标记。 例如利用与抗褐飞虱基因紧密连锁的 SSR 标记在分离群体中进行分子标记辅助选择，获得36份具有纯合目标基因、农艺性状优良、抗性水平在中抗以上的稳定水稻株系。SSR标记技术未来发展 随着对甘蔗基因组序列研究的不断深入、大量 EST 序列的报道、 计算机技术与基因组研究的日益结合，大量的 SSR 序列被发现，这为 SSR 分子标记的应用提供了更广阔的发展空间。发展能够直接标记那些控制农艺性状的等位基因的分子标记是 SSR 标记发展的一个主要方向。 总之，随着基因组学的不断发展，SSR 标记将会被更广泛地用于育种等农业科研领域。SSR的概念 SSR(Simple sequenc repeat)标记即简单序列重复。具体一点就是简单的核苷酸序列的重复。在DNA中主要以 25 个核苷酸为重复单位，如(GA)n、(AC)n、(GAA)n 等，这个n一般为10-50. 由于重复次数n的不同，SSR 序列就有不同的长度，这就构成了它的多态性。因此 SSR 序列非常