现代仪器-荧光教案2011

1、山 东 中 医 药 大 学教 案 首 页教研室主任：吕青涛授 课 人：吕青涛 研究生(部) 2011 年级 中药 专业 班 2011 年 9 月 20日题 目:荧光分析法教学目的与要求:（1）掌握分子荧光、磷光和化学发光的产生机理；掌握激发光谱和发射光谱特征。（2）掌握荧光与分子结构的关系以及溶液的荧光（磷光）强度影响因素。（3）熟悉荧光（磷光）分析法的特点及定量测定方法。（4）了解磷光分析法的类型。（5）熟悉荧光、磷光和化学发光分析仪器的结构。内容与时间分配: 荧光分析原理：120min； 荧光仪器：20min； 分析方法：40min； 磷光分析简介：20min；重点与难点:1、荧光的产生；

2、2、荧光光谱与激发光谱；3、荧光与分子结构4、影响因素5、分析方法教具准备:PPT教 案 内 文荧光分析法（fluorometry）灵敏度高，紫外可见法107g/ml待测物质：分子荧光 原子荧光激发光： 紫外可见荧光 红外可见荧光X射线荧光1、基本原理利用目一波长得光照射试样，使试样吸收这一辐射，然后再发射出波长相同或较长得光，若这种再发射约在10-9秒内发生，称为荧光，利用荧光得强度和特性对物质进行定性、定量分析，称为荧光分析法。当分子轨道中电子吸收光子跃迁，若电子跃迁后，处于自旋方向相反得状态，则总自旋量子数S0，体系的多重性M=2S+1，既为激发态的单线态（此分子在磁场中不产生能级裂分）

3、若电子跃迁后，处于自旋方向相同的状态，则总自旋量子数S=1/2+1/2=1,体系的多重性M=2S+1=3,即为三线态（在磁场中，三线态的电子能级产生裂分，一条线可分裂成三条线。三线态的能量较相应单线态的能量低）。电子由单单跃迁，所需E1<E2(单三) 由于单三的跃迁使禁阻的，所以摩尔吸光系数小分子在室温基本处于电子跃迁的级态，吸收了可见紫外光后，基态分子只能跃迁到激发单线态的各个不同振转能阶，而不能直接跃迁到激发三线态的各个振转能级（自旋禁阻定律）。紫外可见光照射物质，基态分子不断跃迁到激发态，则分子的紫外吸收应逐渐减小至消失，但事实上物质分子能够连续吸收紫外可见光，说明存在一条或多条从

4、分子激发态往基态的途径。振动弛豫：无辐射跃迁，只在同一电子能级内进行。激发态分子由于分子间碰撞或分子与晶格间的相互作用，以热的形式损失掉部分能量，从振动能级的较高能级下降。既激发态不同振动能级间的能量释放，这部分能量以热的形式释放，而不是以光辐射的形式发出，故振动弛豫属于无辐射跃迁。荧光发射电子由激发态的最低振动能级回迁到基态，释放出能量，发射的光为荧光。由于已损失了部分能量，所以荧光的波长<原照射的紫外光波长。内部能量转换：非辐射过程激发态分子将激发态能转变为热能，回到基态。第二电子激发态S2的的振动能级与第一电子激发态的高振能级的E较小，甚至重叠，所以，他们之间的内部能量转换很容易发

5、生，速度很快。因此，分子无论在哪一个激发单线态都能通过内部能量转换到达低一级激发态的最高振动能级；然后通过振动弛豫回到起最低振动能级；最终回到基态的最低振动能级。这一过程成为内部卒灭。大多数物质的内部卒灭过程很快，所以无荧光发出。内部能量转换激发态分子通过碰撞将能量转移给其他分子，直接回到基态，导致外部卒灭。例：溶剂中含荧光卒灭剂或温度较高时，易产生外部卒灭。体系间交叉跃迁电子由激发单线的最低振动能级激发三线态的最高振动多数分子：体系间交叉跃迁时禁阻的。极少数分子可以（如含溴、碘等重原子）因为其自旋轨道的强偶合作用，电子自旋可以逆转方向，时体系跨越容易。磷光发射电子通过振动弛豫从激发态三线态的

6、最高振动最低，然后发出光发射跃迁至基态的各个振动能级，这种光辐射称磷光发射。激发三线态最低振动能级低于单线态所以磷光辐射能量<荧光磷光辐射波长>荧光荧光法不普及：室温下难呈现体系间跨越几率小体系间跨越后，又一改体系间跨跃回到激发单线态荧光分子间碰撞，溶剂间作用，各种卒灭效应。所以，磷光法：液氮冷冻条件下激发。延迟荧光分子在激发三线态的振动基态可以存活一定时间，所以需时较长。2、激发光谱与荧光光谱荧光时分子受激发射光谱，所以有两个特征光谱：激发光谱 发射光谱（1） 激发光谱：以激发光波长为横坐标 荧光强度为纵坐标荧光强度随激发光波长的变化（2） 荧光光谱：以荧光的发射波长为横坐标 荧

7、光的发光强度为纵坐标荧光物质的ex,man和em,max是鉴定的依据，也是定量的依据，（3） 特点：（4） 紫外光谱：紫外光的吸收度荧光物质的激发光谱两者相似，因吸收了紫外线才能发射荧光激发光谱与紫外吸收相似，但不完全重叠荧光光谱与激发光谱相比在长波长处荧光光谱的吸收峰只有一个，且与激发光波长无关。激发光谱与荧光光谱呈镜像关系，例蒽的激发光谱与荧光光谱（在高分辨的荧光光谱图上）激发光谱 a峰：分子基态S0S2* b峰：分子基态S0Si*的（V0、V1、V2、V3、V41、2、为不同的能级）b0峰相当于b0的跃迁线 b1峰相当于b1的跃迁线荧光光谱：C峰：分子从第一电子激发态的振动能级基态跃迁至

8、电子基态的不同振动能级而形成C0峰C0跃迁线C1峰C1的跃迁线3、荧光与分子结构的关系(1) 产生过程:(2) 分子吸收光子，由基态第一电子激发态或第二激发态通过无辐射跃迁回到第一激发态的最低振动能级跃迁到基态的各振动能级发出荧光通过无辐射跃迁回到基态的最低振动能级（2）产生荧光的必要条件分子吸收光能量（紫外可见吸收强），产生跃迁。（n×跃迁弱，所以引起的荧光极弱）吸收后必须具有较高的荧光效率，才能产生荧光物质分子不是吸收荧光紫外光量子，即能够发射一个荧光量子。物质发射荧光的量子数与所吸收的激发态量子数的比值，称为荧光效率或荧光量子产率f发出荧光的量子数/吸收激发光的量子数（3） 荧

9、光强度与分子结构的关系（内部因素）长共軛结构×跃迁产生强K带紫外吸收。电子共軛越长，ex和en将长移。F、f将增大分子的刚性结构和共平面效应分子的刚性结构和共平面效应增大，f增大，且em长移。例：取代基a、 增加分子的电子共軛程度，f增大，em长移的基团NH2,OH,OCH3,NHR,NR2,CN等b、 减弱分子的电子共軛程度，f减小，甚至荧光卒灭的基团COOH,NO2,C=O,NO,SH,NHCONH3,F,Cl，I,-Br等c、 对分子的电子共軛作用小，对荧光影响不明显。R,SO3H,NH3+等4、影响荧光强度的外部因素（1） 温度：温度增大，f小，碰撞几率大，分子运动速度增大，

10、无辐射跃迁增大， （2） 溶剂：a,极性大，f大。红移所以极性溶剂中，E×减小。 b、粘度大，f大，粘度小，分子碰撞几率增大，所以f小（3）PH值的影响：对弱酸和弱碱的荧光物质影响大。PH值不同，离子电离结构不同。如：（4） 荧光熄灭剂：使f减小或荧光强度与浓度不呈线性关系。常见的熄灭剂有：卤素离子、重金属离子，氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基混合物。原因：分子碰撞；产生无荧光的配合物；I、Br溶解O2使易发生体系跨越至三线态；（5） 散射光干扰a、 容器表面：方形影响小，原形影响大。 可通过调整狭缝减小散射。b、 丁达尔散射：胶体颗粒产生的散射可尽量除去胶体颗粒；脱气c、

11、 瑞利散射：瑞利光波长激发光波长 分子吸收光子后，由基态较低振能级较高能级，并在极短的时间内返回原来的能级，释放出与激发光相同波长的光线。d、 拉曼散射分子吸收光子，基态较低振动能级较高能级回到稍高或稍低与原能级的振动能级。拉曼光波长激发光波长可通过减小狭缝加强滤光片选择激发波长来减小拉曼光的干扰。（6） 氢键的影响与溶剂或其它溶液分子产生氢键，对荧光光谱和荧光强度有显著的影响（7） 表示活性剂的影响增溶、增稳、表面活性剂浓度增大胶束对荧光分子有遮蔽作用。减小分子碰撞几率保护激发单线态荧光分子提高f（8） 自卒灭荧光物质浓度过大，>1g/l产生的荧光含被分子吸收。使荧光强度减小，发生浓度

12、卒灭5、荧光强度与浓度的关系（1） 定量关系F（I0-It）F:荧光强度。（I0-It）：被吸收的光强度即F=（I0-It）.KK常数，取决于f根据Beer定律：IT/I0=10-Ecl即：F= KI0(1-10-Ecl)= KI0(1-e-2.3Ecl)= KI02.3Ecl-(-2.3Ecl)/2!-(-2.3Ecl)2/3!-(-2.3Ecl)n/n!当Ecl时，即稀溶液F=K´I02.3Elc=KC所以，浓度低时，F与C成线性关系。（2） 灵敏度高 可通过放大检测信号，增加激发光强度，通过灵敏度。而吸收光谱：A-lgIt/I0It/I0为比值，无法放大（3） 定性、定量分析定

13、性分析：依据激发光谱中地峰位鉴定物质。注意：影响因素多，测到地只是表观光谱图，须校正。一般用对照品对照定量分析方法：工作曲线法 比例法（标准曲线过原点）Fs-F0=KCsF样-F0=KC样 F0:空白溶液荧光强度 多组分测定：与紫外分光光度法定量分析用6荧光分光光度计（1） 主要部件激发光源：疝灯（多用）:连续光源汞灯：发射线光谱，产生不连续地一定波长地光另外：氘灯、卤钨灯等单色器：激发单色器（光源与样品之间） 发射单色器(样品与监测器之间)荧光计：虑光片荧光分光光度计：光栅作色散元件吸收池：石英检测器：光电倍增管 光电二极管阵列检测器：迅速、瞬时测定荧光光谱（2） 类型荧光计荧光分光光度计（

14、3） 校正（4） 波长校正用汞灯地标准谱线对单色器地波长刻度进行校正灵敏度：影响因素较多a光源强度稳定度单色器地性能b波长、狭缝c空白溶液、拉曼散射、激发光、杂质荧光常用：硫酸奎宁溶液作为标准溶液进行校正 光谱校正双光束荧光分光光度计，参比光束抵消光学误差7荧光分析新技术（1） 激发荧光分析：光源:激光、波长纯，强度大检测灵敏度高，样品量<1ul最小可测10-16g测量生化样品、气体样品及有机化合物中地自由基（2）同步荧光分析 灵敏度高在荧光物质地激发光谱和发射光谱中选择适宜地波长差值，同时扫描荧光发射波长和激发波长，得同步荧光光谱。Fsp(em,ex)=KCFexFem(3) 胶束增溶

15、增敏荧光分析加入增溶增敏试剂，如表面活性剂：SDS,CTMAB,CPB,PVA,Triton*100等环糊精：CD，CD,-CD等表面活性剂在临界胶束浓度时，相差疏水基向里，亲水基向外得具有一定大小内腔得胶束，增溶、增敏其用于荧光分析，不仅提高了灵敏度、选择性且可在分子水平模拟生物体系细胞膜结构。对药物在体内的分布和作用机理进行研究。（4） 反相胶束增敏荧光分析法形成亲水基向里，疏水基向外的微囊今年来在膜的模拟化学、蛋白质液液萃取，胶束催化，超细纳米材料制备，有毒物质降解、医药、化工等领域有重要应用。（5） 时间分辨荧光分析根据分子荧光寿命不同，在激发与检测之间间隔一定时间，使不同分子达到分别检测，从而可以消除共存组分的干扰。 将其用于免疫分析，“时间分