GFP融合蛋白引物设计实例

1、引物设计实例分析引物设计基本原则引物长度(primer length )产物长度(product length )序歹 U Tm 值(melting temperature)G+C 含量(composition )引物二聚体及发夹结构( duplex formation and hairpin )阅读框1. 引物的长度一般为 15-30bp,常用的是 18-27bp,但不能大于 38,因为过长会导致其延伸温度大于74 C,即 Taq 酶的最适温度。2. 产物的长度扩增片段长度为 100600 碱基对.3. Tm 值引物的 Tm 值一般控制在 55-60 度，尽可能保证上下游引物的Tm 值一致，

2、一般不超过 2 度.如果引物中的 G+C 含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度Tm=2(A+T)+4(C+G)4. 引物的 GC 含量有效引物中(G+C)的比例为 40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大。5. 引物自身引物间 3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败任务：用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白 NR1pcDNA3.1 wVlO生物秀BQEHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1 的编码序列(MOOObp)121 ggggctccta gagoacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggc

3、ccgcg ggtcgtacat 181cgcgagg+cg tcgcactcgc gcaacccaga gccxaggcccg ctgtgcccgg agctoatgag 241cacca+gcac ctgc+gacat tcgccc+gct t+tcc+gc tcc+tcgcc c gcgcggatcc 301cgaccccaagatcg+caacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatg+t361ccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgc421cact+ctg+c accca

4、caagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt g+gaggocct 481 cctctctagccaggtctacg c+atcctcgt tagccacccg cc+actccca acgoccactt 541 eactcccacc cctgtctcctacacagctgg cttctacaga dtccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagagtatccacctg agtttcct+c gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagat

5、gatgcgagtctacaactggaacca721ca+catcctgctgg+cagcgacgaccacgagggacgggccgcgcagaagc gct+ggagac 781 gttgc+ggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctgcagtt+gccc caggaaccoc红色为信号肽，蓝色为BomHIW切位点，王划线标出酶切位点的阅读框GFP 序列(700bp)ATG&T&AGCAA&GGCGAGGAGCTGTTCACCGG&GTG6T&CCC ATCCTGGTC6 A&CVGGACGG CGAC&

6、;TAAACGGCCACAAGT TCAGC6TGTC C&C6AG6&C GAGGGCGATGCCACCTAC6GCAA6CT&ACCCT&AA&TTCATCTGCACCACCGSCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACCTTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTC&CCCGC TACCCCGACCACTGAA&CA &CACGACTTC TTCAAGTCCG CCAT6CCCGAAG&GVACGTC CAG6A&CGCA CCATCTTCTT CAA&6AC

7、GAC&GCAACVACA AGACCCGCGC C6AG&T&AA& TTCGAG&GC6ACACCCTG&T GAACCGCATC GA&CT&AA&G GCATCGACTTCAAG&AGGAC G&CAACATCC TG&GGCACAA GCTGGASTACAACTACAACA GCCACAAC&V CTATATCAT6 6CC&ACAAGCAGAA6AACG&CATCAA5ffV&AACTTCAA6ATCCGCCACAACTC&AG&AC &a

8、mp;GCA&C&TGC AGCTCGCC&A CCACTACCA&CA6AACACCC CCTCGQC&A CGGCCCCGTT6 CTGCTGCCTACCA&TCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATTCACATGGTCCT GCT&GAGTTC GT&ACC&CC& CCG6GATCACTCTCSGCATS &ACGA&CT6T ACAA&TAA引物要求 PCR 扩增 GFP GFP 两边添加 BamHI 酶切位点 保证 NR1 的阅读框不改变第一步

9、：扩增 GFP 基本序列GFP 序处TCTCGGCATG&AC&A&CTGTACAA&TAA 3一 -31变性,引物复5点TGGT&点心.TCTCtCAT&ACA&CT&TACAA&TAA 3.A&A&CCGJACCT&CTC&ACATGTTCATT 5 PrinwrZPrimarl； 5,ATGGT&A&CAAGGGO&A&A&C.C&CTCCTCG.一.CCTACCTfrCTCfiAGATftTTCATT 5,53 . | J| JRi J

10、JRJWJR-_* Itjr,ITII I I Crf*IffTrf11 IPrimcrl： 5AT&TGA&CA A&C&C&A&QAQCPrimerZ： 5TTACTT&T A CA &CTCGTCCA T&CCGA GA 生物秀bbiop.COrmATCTAGCAAGCQCAA&C.Primark: SCTT&TACA&CTC&TCCA T&CCA第二步：GC 比值;Tm 值Primerl: 5*ATGGTG AGC A A GGGCS A GG APrimerZ: 5CTTG

11、TACMCTCGTCCArr&CCGAGAPritncrl - 5PHmr2: 5ATGGT&MCAAGGGCGAGGA (GC：60%FTm= 64)第三步：酶切位点Primerl: 5*/aGGTGAGCAAGGGCGAGGA (GC:60%.Tm： 64)Pr*imer2: 5CTTffrACAGCVC&TCCATGCC C&C:57%.Tm= 66)Primerl: 5ggatcc A T G&TGAGC A A GGGCG A G& APrimerZ: 5ggatccCTT GT ACAGCVCGTCCATGCC车物秀车物秀第四步：阅读

12、框NR1序atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgctttt+tcc+gctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaagatcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccaggccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctg+c acccacaagc ccaacgccatacagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct.Primerl: 5 ggtsAT&GTGAGCAAGG

13、GCGAGGAIPrimerl; 599atccTATGGT6AGCAAGGGCGAGGAotgGgcaccatgcacctgctgacat+cgccctgct+ttttcctgctccttcgcccgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatg+tccgcgaggcagtaaaccaggccaotcagcgacacggc+ct tggocgotac agctcaacgccacttctgtc accccicaagc ccaacgccat acagatggccctgtccgtgt gtgaggc

14、cctGFP序列5*AT&BAGCAASS&CSAGSA&C.TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3插入GFP后的组合序二生物秀bbioo.ccrn egc gcg gat etcATGGTGAGCAAGGGEGAGGAGCTCTCGCATGGACGAGCTGTACAAG ?ggat ccc gaccccaag atcgtcaacatcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcgacacggctct tggaagatac agctcaacgcccicttctgtc acccacaagc ccaac