天然药物化学北京大学第三课

1、色谱分离法 色谱法（chromatography）：是一种分离和鉴定复杂混合物的有效方法。近来已被广泛应用于天然产物有效成分的分离提纯。对一些性质相近，结构类似化合物分离，采用经典的溶剂法和结晶法已不能达到分离的目的，使用色谱法往往可以收到很好的分离效果。 根据色谱分离原理不同，可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、大孔吸附树脂法、凝胶色谱法、高效液相色谱法、气相色谱法等。 、吸附色谱法（adsorption chromatography）：是利用同一吸附剂对混合物中各种成分吸附能力的差异，而使各成分达到分离的目的的色谱方法。本方法特别适用于脂溶性中等分子量成分的分离。 各种吸附剂表面都存在

2、着吸附活性，对不同的有机化合物，在吸附剂表面都表现出不同的吸附能力，这就是吸附色谱能分离不同物质的基本原理之一。吸附力的强弱是由吸附剂和被吸附物的性质决定的。用一定的溶剂系统展开时，由于溶剂与混合物里 各组分争夺吸附剂活性表面，因此，发生了吸附与解吸附的过程。解吸下来的组分与溶剂始终存在着竞争吸附作用，故随即又被吸附剂所吸附，吸附与解吸附过程一旦开始，就必定贯穿于整个色谱过程，直至色谱结束为止。 不同的化合物由于结构性质上的差异，展开剂对它们的洗脱能力和在吸附剂上的吸附、解吸附性能也是不同的。因而在吸附剂上移动的距离就不会相同，形成各种组分彼此程度不同的被分离，性质差异越大，分离效果越好。 吸

3、附色谱法的分离效果如何，完全是由吸附剂和被分离物质的性质决定的。 通常所用的吸附剂有： 硅胶（silica）：为一多孔性物质，微显酸性，其吸附能力稍弱于氧化铝，可用通式SiO2XH2O来表示。 氧化铝（aluminium oxide）：是常用的吸附剂之一，是由氢氧化铝直接在高温下（约600）脱水制得，由于制造关系常带有微碱性，对于分离植物中的碱性成分如生物碱颇为理想，但不宜用于醛、酮、酯和内酯等类型化合物的分离，因为有时碱性氧化铝可以与这些成分发生次级反应，如异构化、氧化和清除反应等。 聚酰胺（polyamide）：是一类由酰胺聚合而成的高分子化合物。商品名为绵纶、尼龙。对黄酮类、酚类、醌类、

4、有机酸及鞣质的分离效果极佳，可使性质极相近的类似物质得到分离。此外，在生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸衍生物及核苷类的分离上也取得了成功。 活性碳(activated carbon)：属于非极性吸附剂，有着较强的吸附能力，特别适合于水溶性物质的分离。 吸附色谱法的操作方式通常有薄层色谱和柱色谱法。 薄层色谱法(thin layer chromatography,TLC)：是一种快速、简便、灵敏的分离检识方法。薄层色谱将吸附剂均匀地铺在玻璃板上，把欲分析的样品点加到薄层上，然后用合适的溶剂展开而达到分离、鉴定和定量的目的。该方法不仅对分离鉴定天然产物成分起到了独特的作用，在分析化学、药物化学、染

5、料、农药等领域，均得到广泛的应用。 薄层色谱的操作主要包括制板，点样，展开和显色四个方面。 柱色谱法（column chromatography）：也是天然产物成分研究中常用的色谱方法，实质上它是薄层色谱的另一种形式。其分离原理、吸附剂及洗脱剂的选择均与薄层色谱法相同。不同点在于柱色谱法是将分离材料均匀的加入到一定规格的玻璃柱里，再以适当的洗脱剂洗脱，使结构性质不同的成分达到分离。柱色谱法分离样品量大，故大多数情况下均为制备性分离。 、分配色谱法 ：是利用物质在互不相溶的两相溶剂中分配系数不同，而达到分离的一种色谱方法。 基本原理：其基本原理来自两相逆流萃取法。只不过是将互相饱和的一相溶液，设

6、法吸着在某种惰性固体粉末或滤纸上，这一相就称为固定相，这种吸着了固定相的物质称为支持剂（载体或担体）。被分离物质置于固定相上，以另一相即移动相洗脱（或展开），样品中的物质就在固定相与移动相之间分配而达到分离。因此，分配色谱法由载体，固定液相，移动液相，被分离物质四部分组成。 支持剂：作为分配色谱的支持剂均为中性多孔的粉末，无吸附作用，不溶于两相溶剂中，不与被分离物质发生化学反应。并能吸附着一定量的固定相，移动相能自由通过而不改变其组成。常用的支持剂有硅胶、硅藻土、纤维素粉、滤纸等。 溶剂系统：分配色谱中的固定相和移动相统称为溶剂系统。 操作方式：分配色谱法的操作方式有纸色谱，分配薄层色谱和分配

7、柱色谱等。 A、纸色谱(paper chromatography ，PC)是以滤纸作为支持剂，用一定量的溶剂系统展开而使样品达到分离的一种平面色谱法。 B、分配薄层色谱：分配薄层色谱的原理与纸色谱相同，装置及操作与吸附薄层色谱相同，只是铺板用的不是吸附剂而是支持剂。 C、分配柱色谱：装置同吸附柱色谱。将吸着固定相的支持剂装于柱中，样品溶于少量固定相加入柱上端，以移动相进行脱洗，分别收集。 、离子交换色谱法（ion exchange chromatography ，IEC）：是用离子交换剂代替吸附剂的一种色谱方法。该方法在工业上用途很广，在天然产物有效成分的分离方面，特别对水溶性成分氨基酸、肽类

8、、生物碱、有机酸及酚类化合物的分离，比以前方便多了。 A、基本原理：离子交换树脂是一些具有特殊性能的高分子化合物，它们不溶于水、酸、碱和有机溶剂，但是可在水中解离成离子，其解离的离子可与溶液中的其它离子产生可逆交换，而毫无影响本身的结构。由于它与多种离子的亲合力不同，可借此使不同的离子获得分离。根据所交换离子性质不同，将其分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。离子交换色谱的原理用下式表示： 阳离子交换树脂：RSO3-H+ +Na+Cl- RSO3- Na+ + H+ Cl- 阴离子交换树脂：RN+OH- + Na+Cl- RN+ Cl- + Na+ OH- 其中R为树脂母体。 天然产物中有些成分

9、可以离子化，有些成分不能离子化。能离子化的成分在水溶液中可与离子交换树脂反应而被吸附，不能离子化的成分在水溶液中不与离子交换树脂反应，不被吸附，彼此达到分离。 B、操作方法：离子交换色谱法操作方法与柱色谱法基本相似。装柱前树脂要预先用蒸馏水充分溶胀，同时树脂的粒度范围要求窄些为好，否则柱内上下树脂粒度不一，会影响分离效果。 用过的树脂可以再生处理反复使用，一般采用酸碱再生处理法，将盐型转为游离型。 、大孔吸附树脂法(macro-reticular resine)：广泛用于天然产物的分离。并在抗生素及水溶性天然产物成分提纯等方面显示出独特的作用。 A、性能及分离原理：常用的大孔吸附树脂是一种不含

10、交换基团，具有大孔结构的高分子吸附剂。一般为白色颗粒状，粒度多为2060目。理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，不受无机盐类存在的影响。通常可分为非极性和中等极性两类，在水溶液中吸附力较强且有良好的吸附选择性。大孔吸附性树脂为吸附性和筛选性原理相结合的分离材料，所以它既不同于离子交换 树脂，又有别于凝胶分子筛。它所具有的吸附性是由于范德华引力或产生氢键吸附的结果，而筛选性分离则是它的多孔性网状结构所决定的。欲分离的天然产物成分依其分子体积的大小及吸附力的强弱，在一定规格的大孔吸附树脂上，以适当的溶剂洗脱而分开。 B、影响分离因素：有分子极性大小，分子体积，PH值等。 C、树脂柱的清洗：化合物

11、经树脂柱吸附后，在树脂表面或内部残留许多非吸附性成分或吸附性杂质，这些杂质必须在清洗过程中尽量洗除。非吸附性成分用水即可洗除，而吸附性杂质可根据实际情况，选用低浓度的醇溶液，如30%以下乙醇等洗除或进行小试来摸索适宜的洗涤溶剂。 D、洗脱液的选择：洗脱液可使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，根据吸附力的强弱选用不同的洗脱剂。对非极性大孔吸附树脂，洗脱剂极性越小，洗脱能力越强。对中极性大孔吸附树脂和极性较大的化合物，用极性较大的有机溶剂较合适。为达到满意的效果，可设几种不同浓度洗脱，以确定最佳洗脱液浓度。洗速控制在0.55ml/(cm2min)较为合适。洗脱时，根据实际情况，也可采用不同极性梯度的

12、洗脱液分别洗下不同组分。 、凝胶色谱法（gel filtration chromatography，GFC）：是60年代发展起来的一种分离分析技术。其设备简单、操作方便，结果准确。本技术已发展成为天然产物化学和生物化学研究中的常规分离方法。 常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex G)，聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel P)及琼酯糖凝胶(Sepharese，Bio-Gel A)等，其中应用最广泛的当属葡聚糖凝胶。 A、性能及分类：葡聚糖凝胶是由葡聚糖（右旋糖酐）和甘油，通过醚桥键相交而成的多孔性网状结构物质。商品凝胶为干燥颗粒状物质，在使用前必须使其充分溶胀。由于葡聚糖分子中含有大量羟基，而具

13、有一定极性，在水中膨胀为凝胶粒子。它不溶于水及盐溶液，在碱性和弱酸性溶液中稳定，在强酸中，遇高温时可使部分糖甙键水解。葡聚糖凝胶网眼的大小是影响分离效果的主要因素。在制备时可通过添加不同比例的交链剂，获得交链度不同的凝胶。交链度越大，网状结构越紧密，网孔越小，吸水膨胀越大，可用于小分子量物质的分离；反之，交链度小，网孔大，则可用于大分子量物质的分离。 商品凝胶的型号一般是按交链度的大小来分类的，并以每克干凝胶吸水量10倍的数值来表示。如G-25型凝胶表示为每克吸水2.5ml的葡聚糖凝胶。 葡聚糖凝胶LH-20(Sephadex LH-20)是在葡聚糖凝胶G-25的分子中，引入羟丙基以代替分子中

14、羟基上的氢而形成的新型凝胶。由于在其分子内引入了亲脂性的基团，从而使它不仅具有亲水性，而且也有一定程度的亲脂性，这样就大大扩展了凝胶色谱的应用范围，既可用于强极性水溶性化合物的分离，也可用于一些难溶于水或有一定程度亲脂性化合物的分离。 B、分离原理：葡聚糖凝胶吸水后形成凝胶粒子，在其交链键的骨架中存在许多网眼。网眼大的能使大分子量的化合物进入，网眼小的则只能使小分子量的化合物进入。这样，超过一定限度的大分子物质，就被排阻在凝胶粒子的外部，难以进入网眼内部。这就使得能进入凝胶内部与不能进入凝胶内部的化合物分子，如同按照分子大小过筛一样分开，故称为“分子筛”。其基理如下图所示： O：代表凝胶颗粒

15、o：代表大分子物质 ：代表小分子物质 1. 待分离物质在色谱床表面； 2 .样品进入色谱床，小分子进入凝胶 颗粒内部，大分子随溶液流动； 3. 大分子物质行程短，流出色谱床， 小分子物质仍然缓慢移动。 因此，在多种成分进行凝胶色谱分离时，从柱中流出的次序是按分子量递减的顺序排列的。但是，某些凝胶也不全是惰性的，在溶质与葡聚糖凝胶之间也会形成特殊的吸附作用。在用葡聚糖凝胶LH-20( Sepha-dex LH-20)分离游离态的黄酮类的化合物时，主要是靠吸附作用，酚羟基多的化合物吸附力大，难洗脱，酚羟基少的吸附力小，先出柱；而用同样规格的凝胶来分离黄酮甙时，分子筛则起主导作用，黄酮甙类基本上是按

16、分子量由大到小的顺序流出柱体。 C、应用：凝胶色谱法目前已被广泛应用于天然产物有效成分的分离纯化工作中，它是水溶性大分子化合物质分离上常用的方法之一，实践证明它对小分子量物质的分离也是有效的。随着新的凝胶材料的不断问世，凝胶色谱法的应用范围也在不断扩大。 、高效液相色谱法（high performance liquid chroma-tography, HPLC）：是新发展起来的一种液相色谱方法。由于高效填充剂和各种灵敏检测器的出现和发展，使该法在分离效率、分析速度、检出灵敏度及自动化等方面均达到了新的境界，形成了独特的体系。随着计算机技术的迅猛发展，促进了新型高效液相色谱仪的问世，同时，使高

17、效液相色谱与质、核磁、红外等波谱技术的联用也有很大的进展，这对复杂混合物的分离和分析是一种十会有用的方法。 近年来，高效液相色谱在天然产物成分研究、有机化工、环境化学及高分子工业等方面已经得到了广泛的应用。尤其在天然产物成分鉴定、含量测定及结构类似组分的分离上越来越显示出它的重要性。 喜树碱（Camptothecine）中抗癌活性成分的分离：喜树为珙桐科乔木，从该植物中分离得到的一类含内酯环结构的生物碱，是抗肿瘤的活性成分。下图为使用高效液相色谱仪从喜树中分离得到的四种喜树碱的类似物。采用的是薄壳多层小球ODS柱作为固定相，以55%甲醇-水为移动相所组成的反相系统。在这种情况下，极性大的试样组

18、分（羟基喜树碱）保留时间短， 先被洗脱出来，极性小的试样 组分（脱氧喜树碱）保留时 间长，最后被洗脱出柱。 、气相色谱法（gas chromatography，GC）：是现代分离、分析天然产物的一种重要手段。随其分离检测技术的日益完善，已成为石油化工、药物代谢、毒药分析及环保监测必不可少的测试工具，在天然药物研究上也有着广泛的前景。挥发油是一类具有较强生理活性的天然产物，因具有沸点低、易挥发的特性，故气相色谱法特别适宜对其分离分析。中成药制剂大多是复方制剂，长期以来缺乏明确的标准来控制其内在质量，近年来用气相色谱法定性，定量地测定中成药中的主要成分，控制内在质量，方法简单可靠。气相色谱技术对鉴

19、别生药的真伪优劣，对临床血药浓度的监测，对药代动力学及药效学等方面的研究，均起到了促进作用。 近几年来，随着气相色谱技术作为分离手段，用质谱仪充当分析工具，大型GC-MS联用仪还配有计算机微处理系统，使数据处理自动化，既迅速又准确。 天然药物化学成分结构测定 天然产物化学成分经过提取、分离、精制成单体化合物后，必须进行鉴定，确定其化学结构，才有可能为人工合成，结构改造和药物设计提供可靠的依据。 一、鉴定天然产物化学成分的一般步骤 鉴定天然产物化学成分的基本步骤有：物理常数的测定；分子式的测定；化合物功能基和分子骨架的推定；化合物结构式的确定。 A、物理常数：确定物理常数之前首先要确定化合物的纯

20、度，如是固体测定熔点、熔距、比旋度、比重，如是液体还需要测定沸点、冰点等。 B、分子式的测定：对单体进行元素分析，然后再确定各种元素在化合物中所占的百分含量，从而求出化合物的实验式，并依据测出的分子量，计算出该化合物的分子式，该法测定分子量的方法比较经典，但是精确度不高，因为，单体纯度不高时，误差越大，所以测出来的分子式只能是近似式，有时，还需做较大幅度的调整。对分子量的测定，过去常用冰点降低法，衍生物推导法，酸碱测定法，现在通常是用质谱法。 C、化合物功能基和分子骨架的推定：通常决定该化合物的缺氢因素，准确计算出结构中含有的双键数或环数，并结合所测的物理常数，化学定性试验、化学降解等反应，以

21、及所测的UV、IR、NMR和MS等波谱数据，综合分析，以确定化合物含哪些功能基，具何种母体，属于哪类化合物。 D、化合物结构式的确定：根据UV、IR、NMR和MS及X单晶衍射等许多新的物理分析手段，并借用化学方法进一步确定化合物的具体结构式。现在，由于现代化仪器的出现，使测定天然产物成分结构鉴定工作也进入了一个新的阶段。以前用纯粹的化学方法测定一种新的化合物的结构需要20年、30年甚至100年、200年等，而现在只需要5年、3年甚至1年或半年即可。 但是不管怎么样，确定一种新的天然化学成分的分子结构式，是一个系统工程，是一项较复杂的工作，涉及面广，很难有一个严格的研究程序。往往是化学工作、仪器

22、分析、植物化学分类学及文献工作的相互配合，综合分析而获得的结果。 结构测定中常用的波谱简介 化学物质结构测定中常用的波谱有：紫外吸收光谱（UV）、红外吸收光谱（IR）、质谱（MS）和核磁共振谱（NMR）等。这些波谱技术是测定天然产物成分结构的重要手段。它具有微量、快速、准确等特点，波谱技术已经成为广大药学工作者必须掌握的一门技术。 A、紫外吸收光谱（ultraviolet absorption spectrum，UV）,是用不同波长的紫外光为光源（常用波长范围为200400nm），依次照射一定浓度的样品溶液，分别测量其吸收度，并用波长对吸收度或摩尔吸收系数作图而得的吸收光谱图。 天然产物成分吸

23、收了紫外光，引起分子价电子的跃迁，即由基态吸收一定能量后被激发到高能阶的激发态。所吸收能量的大小（E）与化合键的类型有关，也就是与化合物质结构有关。 键、键和独立电子n(p)的E可用下图表示： 只有在分子结构中具有共轭双键，发色团和共轭体系的助色团，即在分子中具有产生 *、n *跃迁和某些 n * 跃迁的化合物才能在紫外光区产生紫外吸收光谱。 如果化合物具有紫外吸收光谱，则可根据紫外吸收光谱曲线最大吸收峰位置及吸收峰的数目和摩尔吸收系数来确定化合物的基本母核，或是确定化合物的部分结构。 紫外光谱从一个侧面反映了分子结构的内在联系，它可以提供许多有关结构推测的线索。如诱导效应、共轭效应及同分异构

24、、顺反异构、空间位阻等现象，紫外光谱均可给出衡量的依据，这对天然产物成分结构的研究有重要的价值。 带有发色基团的天然产物成分，其紫外吸收峰的位置及相对强度，已经作为一般物理常数，用于结构鉴定工作。当有标准品时，可将检品与标准品的紫外光谱进行对照，若两个化合物相同，其紫外光谱就完全相同。但是，由于紫外光谱是分子价键电子跃迁所产生的，所以，UV中出现的吸收峰只能显示分子中部分结构的特征而不能显示整个分子的细微结构。因此，紫外光谱相同也不一定为相同的分子。如果无标准品作为对照，则可查找有关光谱文献及卡片进行核对。 紫外光谱是研究不饱和有机化合物结构常用的方法之一。对于确定分子中是否含有某种发色团（即

25、不饱和部分的结构骨架）是很有帮助的。 天然产物成分构型不同，其紫外光谱的max 也不同。由于立体障碍的原因，通常反式（trans）异构体的共轭效应较完善，吸收峰的max及max值均 较相应的顺式（cis）异构 体大，如下图所示，所以 据此即可判断化合物是顺 式或反式构型。 由于紫外吸收光谱图 形比较简单，而且不同的 化合物也可能具有相同的 紫外吸收光谱图形，因此， 不能只根据紫外吸收光谱 来判定是不是同一化合物， 但是同一化合物必定具有 相同的紫外吸收光谱。 B、红外吸收光谱(infrared absorption spectrum，IR)通常是采用2.515m(4000667cm-1)范围内

26、的不同波长的光波为光源，依次照射样品，经自动描绘所得的吸收光谱曲线。其横坐标是波数（cm-1）或波长（m），纵坐标是百分透光度。由于纵坐标是百分透光度而不是吸收度，故红外吸收光谱曲线和紫外吸收光谱曲线的峰是相反的，即红外吸收光谱中的吸收峰，实际是向下的“谷”。 红外光谱是化合物分子结构的客观反映。某个化合物的红外光谱图同它的熔点、沸点等物理常数一样，是该化合物的特征，尤其是有机化合物的红外吸收峰多达几十个。如同人的指纹一样彼此各不相同，因此用它来研究天然产物成分的结构，既简便迅速又可靠，应用十分广泛。在实际结构鉴定工作中，往往并不要求测全未知成分的结构，而仅仅要求弄清楚样品是否为某已知成分，在

27、这种情况下，应当用已知的标准图谱或用已知标准品在同一条件下测出的吸收图谱进行核对，若完全相同，通常可以作出最后的决定。若有微小的差别，应当进一步将样品进行精制，然后再进行核对。 应用红外光谱测定分子中的基团，是利用各基团的特征吸收峰所出现的波长，强度和形状来判断的，具有不同的功能团和化学键的化合物的IR吸收特征是不同的，这对未知成分化学结构的推测与确定，提供了极有价值的资料。此外，IR还可提供化合物分子的几何构型与立体构象的研究信息。对于结构简单的未知成分测定，可依靠IR提供的图谱，结合其它数据推测其结构；对结构比较复杂的未知成分，尚须配合UV、NMR、MS和经典的化学方法综合判断，方可初步确定其结构。 C、核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)是有磁距原子核（如H、13C），在磁场作用下，以射频进行照射，产生能级跃迁