DNA的重组与转座讲义

1、第九章 DNA的重组与转座n重组的定义重组的定义n遗传重组的类型遗传重组的类型n同源重组的分子机制同源重组的分子机制n重组和酶重组和酶n位点特异性重组位点特异性重组n转座转座n转座的机制转座的机制n遗传重组的应用遗传重组的应用6.0 重组重组nDNA分子的断裂和重新连接导致遗传信息的重新组合，称为重组（recombination）。重组的产物称为重组DNA（recombinant DNA），所有的DNA都是重组DNA。由于重组，一个DNA分子的遗传信息可以和另一个DNA分子的遗传信息结合在一起，也可以改变一条DNA分子上遗传信息的排列方式。DNA重组广泛存在于各类生物中，说明重组对物种生存具有

2、重要意义。通过重组实现基因的重新组合使物种能够更快地适应环境，加快进化的过程。此外，DNA重组还参与许多重要的生物学过程，比如重组在DNA损伤修复和突变中发挥重要作用。6.1 6.1 遗传重组的类型遗传重组的类型 根据对DNA序列和所需蛋白因子的要求，可有三种类型的重组。其共同点是这些过程都涉及双链DNA之间的物质交换，但其发生的情况有所不同。遗传重组的三种类型遗传重组的三种类型（1 1）同源重组同源重组 它的发生是依赖大范围的DNA同源序列的联会。在重组过程中，两个染色体或DNA分子交换对等的部分。需要重组的蛋白质参与，eg.大肠杆菌中的RecA蛋白、RecBCD蛋白；蛋白质因子对DNA碱基

3、序列的特异性要求不高；（存在重组热点和序列长度的影响）真核生物染色质的状态影响重组的频率。特点特点：同源重组可能发生在两条同源的DNA的任意位点(3)(3)异常重组异常重组 完全不依赖于序列间的同源性而使一段完全不依赖于序列间的同源性而使一段DNA序列插入序列插入另一段中，但在形成重组分子时往往是依赖于另一段中，但在形成重组分子时往往是依赖于DNA复制而复制而完成重组过程。完成重组过程。eg.转座作用，需要转座酶和对转座区域转座作用，需要转座酶和对转座区域DNA的复制。的复制。(2)(2)位点专一性重组位点专一性重组 重组依赖于小范围同源序列的联会，发生精确的断裂、连重组依赖于小范围同源序列的

4、联会，发生精确的断裂、连接，接，DNA分子并不对等交换分子并不对等交换 eg. -phage DNA对对E.coli 的整合的整合(attPattB)，需要有，需要有15 bp的同源序列和专一性的蛋白质因子参与。的同源序列和专一性的蛋白质因子参与。 位点专一重组发生在两条特定的序列，两条重组DNA的其他序列则是不同的。位点专一重组能使二聚体环状DNA分子产生两个单体环状DNA分子6.2 6.2 同源重组的分子机制同源重组的分子机制同源重组（同源重组（homologous recombination）发生在两个同源）发生在两个同源DNA分子之间。真核细胞减数分裂过程中，同源染色体彼此分子之间。真

5、核细胞减数分裂过程中，同源染色体彼此配对，同源染色体配对，同源染色体DNA片段发生交叉与互换。片段发生交叉与互换。Darlington D. C.于于1936年提出：减数分裂同源染色体联会时，年提出：减数分裂同源染色体联会时，非姊妹染色单体由于缠绕而产生张力，两个染色单体在同一非姊妹染色单体由于缠绕而产生张力，两个染色单体在同一位置断裂、重接，以消除张力，从而产生重组。位置断裂、重接，以消除张力，从而产生重组。6.2.1 断裂与重接模型断裂与重接模型First Meiotic Interphase (cells contain 4N DNA content) Bivalent sister c

6、hromatidsalign with each other, thisact is termed synapsis.Synapsed sister chromatidsare termed a synaptonemal complex) Figure 5-55, page 185两条同源两条同源DNADNA分子彼此并排对齐，相互配对分子彼此并排对齐，相互配对DNADNA中两中两个方向相同的单链在个方向相同的单链在DNADNA内切酶的作用下内切酶的作用下, ,在相同位在相同位置上同时切开。在切口处置上同时切开。在切口处发生链的交换发生链的交换，形成所谓，形成所谓的的连接分子连接分子（joint

7、 moleculejoint molecule），也称），也称HollidayHolliday结结构（构（Holliday structureHolliday structure）。）。分支点可以发生移动，称为分支迁移（分支点可以发生移动，称为分支迁移（branch branch migrationmigration），分支迁移的结果是在两个），分支迁移的结果是在两个DNADNA分子中分子中形成异源双链区（形成异源双链区（heteroduplexheteroduplex）。）。1. Holliday modelSynapsedchromatidsRecombinationjointHetero

8、duplex DNA 链交换所形成的连接分子必须进行拆分，才能形成链交换所形成的连接分子必须进行拆分，才能形成两个独立的双链分子。两个独立的双链分子。这需要再产生两个切口。反应结果要看切开的是哪这需要再产生两个切口。反应结果要看切开的是哪一对链，如果切口发生在当初未切的两条链上，那一对链，如果切口发生在当初未切的两条链上，那么原来的么原来的4 4个链就全被切开，就会释放出剪接重组个链就全被切开，就会释放出剪接重组DNA(spliceDNA(splice recombinant DNA) recombinant DNA)分子。分子。ABBAABABABBAHolliday intermediat

9、esABBAA BA BA BA BEndonucleasesaka. resolvases(e.g. RuvC)Products beforeDNA repairHolliday Intermediate(see Photo inLehninger pg 962) 如果切口发生在当初被切的两条链上，连接分子如果切口发生在当初被切的两条链上，连接分子拆分后将形成补丁重组体（拆分后将形成补丁重组体（patch recombinantpatch recombinant）。）。分开的两个分开的两个DNADNA分子除保留了一段异源双链分子除保留了一段异源双链DNA DNA 外，外，均完整无缺。均完整无

10、缺。因此，连接因此，连接DNADNA分子无论如何拆分，所形成的两个分子无论如何拆分，所形成的两个独立的独立的DNADNA分子总有一段异源双链区，但是异源双分子总有一段异源双链区，但是异源双链区两侧的重组未必同时发生。链区两侧的重组未必同时发生。Termed “patch recombinants”两条双链体DNA分子间的重组关键是单链的交换。当双链体DNA的单链与相对应的另一双链体中的单链发生置换时，会产生一个分叉结构。交换产生异源双链体DNA片断，两条单链分别来自父本和母本。联合分子可以通过切开相接的链从而形成两条分开的双链体分子。DNA双链体配对同源链被切出缺口在双链体之间，断裂链交换靠分

11、叉迁移，使交叉点移动在双链体间第二链交叉，切口被封闭两条配对双链体DNA的重组包括相互的单链交换、分叉交换和缺口的切出。Holliday模型模型nHolliday R.于1964年提出旋转显示Holliday接头结构 切口控制结果根据链被切出缺口的位置, Holliday结构的结果可产生亲本双链体或重组双链体.两种类型的产物都有一段异源双链体DNA.n Holliday模型能够较好解释同源重组现象，但也存在问题。该模型认为进行重组的两个DNA分子在开始时需要在对应链相同位置上发生断裂。DNA分子单链断裂是经常发生的事，但很难设想两个分子何以能在同一位置发生断裂。6.2.3 Meselson-R

12、adding模型模型l Holliday模型中为对称的杂合双链，而实际情况有不均等分离现象。l1975年，Matthew Meselson 和 Charles Radding对Holliday 模型进行了修改。 nHolliday模型要求在两个并排对齐的同源DNA分子的对应位点形成单链切口，从而产生游离的单链末端。然而，在Meselson-Radding遗传重组模型中，仅在一个双螺旋上产生单链切口。利用切口处3-OH合成的新链把原有的链逐步置换出来，使之成为以5P为末端的单链区。随后游离的DNA单链侵入另一条DNA双螺旋中，取代它的同源单链并与其互补链配对形成异源双链区，被置换的单链形成D环（

13、D-loop）。nD环单链区随后被切除,两个DNA分子在DNA连接酶的作用下形成Holliday交叉。与Holliday不同，此时只在一条DNA分子上出现异源双链区。如果发生分支迁移，在两条双螺旋上均出现异源双链区。随后发生的连接分子的拆解与Holliday模型一样。n但是更多的事实表明，重组是由双链断裂所启动。现在认为，同源重组是减数分裂的原因，而不是减数分裂的结果。DNA分子双链断裂才能与同源分子发生链的交换，藉以将同源染色体分配到子代细胞中去。因此，双链断裂启动重组，也启动了减数分裂。6.2.4 6.2.4 双链断裂重组模型双链断裂重组模型（model of double-strand

14、breaks recombination） n一条染色体的两条链都发生了断裂，断裂是由内切酶水解磷酸二酯键的结果。nDNA断裂之后由核酸外切酶扩大缺口, 接着是断裂链的游离3端插入到具有完整双链的同源染色体中，形成D-环结构。n在DNA聚合酶的作用下，断裂两条链分别以完整链为模板开始合成, 最后再通过断裂重接过程完成重组。在受体中形成双链断裂断裂扩大为含有3端的间隙3端转到其他的双链体上3端的合成替换了间隙的一条链置换的链迁移到其他双链体上DNA的合成发生于其他3端间隙被供体序列替代相互移动产生了双交换6.3 重组和酶重组和酶n在原核生物同源重组中存在8个碱基组成的Chi位点（重组热点） 5

15、GCTGGTGG 3 3 CGACCACC 5 在E.coli中每隔约510 kb有一个拷贝nRec和Ruv蛋白参与重组。RecA蛋白蛋白nRecA具有单链具有单链DNA和双链和双链DNA的结合活性，的结合活性，能启动能启动DNA单链和与之互补的双链分子进单链和与之互补的双链分子进行碱基配对行碱基配对催化单链取代。催化单链取代。n RecA能促进能促进SOS反应中的蛋白酶活性。反应中的蛋白酶活性。 单链取代单链取代 (single-strand uptake)n其中一个DNA 分子要有单链区；n其中一个DNA 分子要有游离的3末端；n单链区和3末端可和另一DNA分子互补。 RecA具有的处理D

16、NA活性使一条单链能与一条双链体中的同源部分发生置换，这个反应称为单链同化。这个置换反应可发生在几种不同构型的DNA分子之间，但要具备3个条件：在双链体与单链分子之间RecA催化链交换只要其中的一条反应链有游离端, RecA就能促进入侵的单链同化于双链体DNA中RecA蛋白介导的蛋白介导的DNA链交换模型链交换模型nRecBCD复合体具有核酸酶，解旋酶和ATPase活性。n在Chi位点产生单链3游离未端.nChi位点能够改变RecBCD的酶活性。一旦RecBCD识别出Chi序列，RecBCD核酸酶活性便发生变化，其35外切酶活性受到抑制，53外切酶活性被激活，由原来优先降解3末端链，改变为只降

17、解5末端链。但是它的解旋酶活性未受到影响。 nRecBCD酶活性变化的结果是产生3末端带有Chi位点的ssDNA。RecBCD蛋白RecBCD核酸酶从一边开始向chi位点前进, 当它前进时,它降解DNA, 在chi位点,它进行核酸内切, 而后失去RecD,并保留解旋酶活性.nRuvA可识别 Holliday的连接点结构nRuvB是ATPase，可发动迁移反应nRuvC是一种内切酶， 可特异识别Holliday分枝， 它在体外可切这个连接体，解离重组中间体。 Ruv 蛋白RuvAB是个不对称的复合体，它推进Holliday结合点的分叉迁移损伤DNA的复制产生间隙RecA介导链交换第二链交换间隙由

18、DNA合成来填补RuvAB介导分叉迁移RuvC切除Holliday连接点6. 4 位点特异性重组位点特异性重组n位点特异性重组是发生在DNA上特定序列之间的重组，不依赖于DNA顺序的同源性，由能识别特异DNA序列的蛋白质介导，并不需要RecA蛋白和单链DNA。6. 4 位点特异性重组位点特异性重组n噬菌体DNA侵入大肠杆菌细胞后，面临着裂解生长和溶原生长的选择。要进入溶原状态，游离的噬菌体DNA要插入到宿主的染色体DNA中去，这个过程称为整合（integration）。由溶原生长进入裂解生长，DNA又必须从宿主染色体上切除下来，这个过程称为外切（excision）。n整合和外切 均需要通过细菌

19、DNA和DNA特定位点之间的重组来实现，这些位点称为att位点（attachment site）。 n噬菌体的int编码整和酶来催化整和反应。位点专一性重组的位点专一性重组的核苷酸序列核苷酸序列n1. POP: O为为15bp(核心核心)富含富含A-T的的非对称序列；非对称序列； P为为-160 0的的160bp序列序列 P为为0 80的的80bp序列序列n2. BOB: B为为-11 0序列序列 B为为0 11序列序列噬菌体的整合和切除噬菌体的整合和切除共共240bp共共23bp通过在通过在attB和和attP之间的之间的相互重组，噬菌体环状相互重组，噬菌体环状DNA转变成线性的前噬菌转变成

20、线性的前噬菌体；而通过在体；而通过在attL和和attR之间的相互重组，前噬菌之间的相互重组，前噬菌体能被外切出来。体能被外切出来。n-DNA对E.coli的整合： POP + BOB BOPPOB需要整合酶(Int拓扑异构酶活性)和整合宿主因子(IHF)参与n-DNA从E.coli的切离： BOPPOB POP + BOBn需要整合酶(Int)、整合宿主因子(IHF)和切除酶(Xis)参与。所有这些蛋白质都结合到attL和attR的P和P臂上，而attL和attR中央的核心序列并排对齐排列促进原噬菌体的切除。噬菌体的整合和切除噬菌体的整合和切除整合的过程:n具有对特异性DNA强烈亲和力的In

21、t与attP和attB位点结合；n Int的拓扑异构酶活性，使两条双链各自断开一条单链，瞬间旋转然后交换连接，形成Holliday中间体，n在另两条单链之间发生同样的断裂重接，从而完成双链间的重组。Int和IHF结合到attP的不同位点，在核心区域的Int识别位点包括被切割位点attB和attP的共同核心序列的交叉切割允许成十字架状的连接，使相互之间能产生重组连接点。转转 座座l 在生物的基因组中存在一类特殊的在生物的基因组中存在一类特殊的DNA序列，它们能够作序列，它们能够作为独立的单位从基因组的一个位置移动到另一个位置，这种能为独立的单位从基因组的一个位置移动到另一个位置，这种能够改变自身

22、位置的够改变自身位置的DNA序列被称为转座子（序列被称为转座子（transposons）。）。 所有的转座子都有两个基本特征。所有的转座子都有两个基本特征。首先，转座子的两端为反向重复序列（首先，转座子的两端为反向重复序列（inverted repeatinverted repeat）。）。第二，转座子至少含有一个编码转座酶（第二，转座子至少含有一个编码转座酶（transposasetransposase）的基）的基因。因。很多转座子还携带有与转座不相关的基因，例如抗生素抗性很多转座子还携带有与转座不相关的基因，例如抗生素抗性基因、毒性基因等。这些基因位于转座子内，随转座子一起基因、毒性基因等

23、。这些基因位于转座子内，随转座子一起从一个从一个DNADNA分子移动到另一个分子移动到另一个DNADNA分子，对基因组的进化产生分子，对基因组的进化产生了十分重要的影响。了十分重要的影响。DNADNA转座子转座子 （一）细菌的（一）细菌的DNADNA转座子转座子1. 1. 插入序列插入序列 (insertion sequences, IS )(insertion sequences, IS )插入序列是最简单的转座子。典型的插入序列长插入序列是最简单的转座子。典型的插入序列长7507501500 1500 bpbp，具有，具有101040 40 bpbp长的末端反向重复序列。长的末端反向重复序

24、列。ISIS元件的两个元件的两个末端并非是十分精确的反向重复序列。末端并非是十分精确的反向重复序列。所有的所有的ISIS元件都含有一个编码区，它编码的转座酶能识别元件都含有一个编码区，它编码的转座酶能识别ISIS元件的末端重复序列，为一种介导转座过程关键蛋白质元件的末端重复序列，为一种介导转座过程关键蛋白质组分。转座酶对组分。转座酶对ISIS元件两个边界的识别保证了元件两个边界的识别保证了ISIS元件作为元件作为一个整体在基因组中移动。一个整体在基因组中移动。ISIS元件位于细菌的染色体上，也存在于噬菌体和质粒元件位于细菌的染色体上，也存在于噬菌体和质粒的的DNADNA分子中。在大肠杆菌的染色

25、体中发现了几个拷贝分子中。在大肠杆菌的染色体中发现了几个拷贝的的IS1IS1、IS2IS2和和IS3IS3。F F因子中没有因子中没有IS1IS1，但有一个拷贝的，但有一个拷贝的IS2IS2和两个拷贝的和两个拷贝的IS3IS3。当质粒和染色体上具有相同的。当质粒和染色体上具有相同的ISIS元件时，质粒可以通过同源重组整合到宿主细胞的元件时，质粒可以通过同源重组整合到宿主细胞的染色体上。染色体上。复合转座子复合转座子 (composite transposon ) 中心区携带有抗药性标记中心区携带有抗药性标记(Drug marker)(Drug marker)，两侧有，两侧有被称为模块（被称为模

26、块（modulemodule）的）的ISIS元件或类元件或类ISIS元件。元件。 每个每个ISIS元件都有以倒转重复序列为末端的一般结元件都有以倒转重复序列为末端的一般结构，所以复合转座子也是以同样的倒转重复序列为构，所以复合转座子也是以同样的倒转重复序列为末端的。有些复合转座子两侧末端的。有些复合转座子两侧ISIS序列是相同的序列是相同的 , ,另另一些例子中，模块高度同源但不相同。与一些例子中，模块高度同源但不相同。与ISIS序列一序列一样，复合转座子的转座也会在靶基因组中产生短的样，复合转座子的转座也会在靶基因组中产生短的正向重复。正向重复。Tn3Tn3 转座子转座子 Tn3Tn3代表另

27、一类更为复杂的转座子。这类转座子的代表另一类更为复杂的转座子。这类转座子的两个侧翼序列不是两个侧翼序列不是ISIS或类或类ISIS序列，而是短的倒转重复序列，而是短的倒转重复序列；序列；Tn3Tn3的反向重复序列的长度是的反向重复序列的长度是38bp38bp。在两个倒。在两个倒转重复序列之间有转重复序列之间有3 3个基因。个基因。 A map of transposon Tn3.转座的分子机制转座的分子机制 转座子可以通过两种机制进行转座。一种是保守型转座转座子可以通过两种机制进行转座。一种是保守型转座（conservative conservative transpositintranspo

28、sitin），一种是复制型转座），一种是复制型转座（replicativereplicative transposition transposition）。在保守型转座中，转座元）。在保守型转座中，转座元件从供体位点上切除，然后插到靶位点上，因此这个机制又叫件从供体位点上切除，然后插到靶位点上，因此这个机制又叫做剪切粘贴转座（做剪切粘贴转座（cut-and-paste transpositioncut-and-paste transposition）。在复）。在复制型转座中，转座子被复制，转座的制型转座中，转座子被复制，转座的DNADNA序列是原座因子的一序列是原座因子的一个拷贝，而不是它本身

29、。因此，复制型转座伴随着转座子拷贝个拷贝，而不是它本身。因此，复制型转座伴随着转座子拷贝数的增加。数的增加。 1.1.保守转座保守转座 某些细菌转座子某些细菌转座子，包括很多包括很多ISIS元件和复合转座子元件和复合转座子，都，都是通过一种称为剪切是通过一种称为剪切粘贴机制进行转座的。这种相粘贴机制进行转座的。这种相对简单的机制是一个保守的过程，即只有靶序列被复对简单的机制是一个保守的过程，即只有靶序列被复制，而原始的转座子则不发生复制。制，而原始的转座子则不发生复制。2. 2. 复制型转座复制型转座 进行复制型转座的转座子除了具有编码转座酶的进行复制型转座的转座子除了具有编码转座酶的基因外，

30、还具有编码解离酶（基因外，还具有编码解离酶（resolvaseresolvase）的基因）的基因以及解离酶的作用位点，即内部解离位点以及解离酶的作用位点，即内部解离位点（internal resolution site, IRSinternal resolution site, IRS）。）。 69(四)真核生物DNA转座子 1.1.玉米胚乳颜色的控制因子玉米胚乳颜色的控制因子花斑色是由于突变造成的，而且这种突花斑色是由于突变造成的，而且这种突变不是常规突变，是与一种变不是常规突变，是与一种“控制因子控制因子”（controlling element)的存在引起的。的存在引起的。（2）解释）解

31、释如果有如果有C基因，胚乳合成色素，呈紫色；基因，胚乳合成色素，呈紫色；如果如果C突变（突变（c），胚乳无色素，呈白色。），胚乳无色素，呈白色。在在c胚乳的发育过程中，部分细胞发生恢胚乳的发育过程中，部分细胞发生恢复突变（复突变（C），形成色斑。），形成色斑。突变发生的越早，色斑就越大。突变发生的越早，色斑就越大。（1）杂交结论 McClintockMcClintock认为原来的认为原来的c c突变是由一个突变是由一个“可移动可移动的控制因子的控制因子”（现在称转座子）引起的，称为（现在称转座子）引起的，称为DsDs，即解离因子（即解离因子（dissociatordissociator）。它可

32、以插入到）。它可以插入到C C基因基因中。另一个可移动的控制因子是中。另一个可移动的控制因子是AcAc，称激活因子，称激活因子（activatoractivator），它的存在能够激活），它的存在能够激活DsDs转座进入转座进入C C基基因或其它基因，也能使因或其它基因，也能使DsDs从基因中转出，使得突变从基因中转出，使得突变基因回复突变成野生型基因，这就是著名的基因回复突变成野生型基因，这就是著名的Ac-DsAc-Ds系统。系统。（3）对突变的解释：Ac-Ds系统为什么总是恢复突变、而且高频率？为什么总是恢复突变、而且高频率？McClintock认为认为C突变为突变为c是由于一个是由于一个“可移动的控制因子可移动的控制因子”（transposable controlling element）的插入引起的，她）的插入引起的，她称之为称之为Ds（dissociator）。）。 解离因子解离因子Ds另外还有一个控制因子另外还有一个控制因子Ac（activator），），它能激活：它能激活： 激活因子AcDs插入插入C基因（引起突变），基因（引起突变），或从或从C基因中转出（恢复突变）。基因中转出（恢复