银杏叶片微生物限度检查法适用性试验(20151012)

1、编 号：QTQC1221512浙江佐力药业股份有限公司验证文件项目名称：银杏叶片微生物限度检查法适用性试验方案编号： QTVPQC122-1512报告编号：QTVRQC122-1512证书编号：QTVCQC122-1512归档日期： 目 录一、验证方案二、验证报告三、验证批准证书文件编号：QTVPQC122-1512银杏叶片微生物限度检查法适用性试验方案方案起草方案起草人起草日期方案审核方案审核人审核日期审核日期审核日期审核日期方案批准方案批准人批准日期1验证参加人员及其职责部门姓名职责QC验证方案起草、负责实施QA负责取样，进度跟踪及信息沟通质量技术部验证方案、报告审核，负责验证组织实施、评

2、价及偏差调查质量技术部验证方案、报告审核与批准2.概述银杏叶片是我公司生产的口服固体片剂，主要用于活血化瘀通络。用于瘀血阻络引起的胸痹、心痛、中风、半身不遂、舌强语謇；冠心病稳定型心绞痛、脑梗死见上述证候者。其处方为单位处方 批生产量银杏叶提取物 40 50kg微晶纤维素 27.6 34.4kg淀粉 100.8 126kg蔗糖 20.8 26kg硬脂酸镁 0.8 1kg30%乙醇 72g 90 kg 制成 1000片 125万片主要工艺为原辅料过筛，称量，混合制粒，沸腾干燥，整粒，总混，压片，包衣，铝塑包装，外包。经前期方法确认，本品不具有抑菌性（见银杏叶片微生物方法检查验证报告编号VP-QC

3、-026），确认检查方法为：取本品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，溶解，混匀，制成1：10均匀供试液。细菌数、霉菌和酵母菌数检查：取1：10供试液按常规法检查（平皿法）。3.验证目的由于中国药典2015年版四部1100生物检查法之1105、1106非无菌产品微生物限度检查法与2010年版规定的方法和条件有所变化，现对新版药典规定的检查法适用性进行确认，以确认所采用的方法适合本产品的无菌检查。4.接受标准4.1需氧菌总数、霉菌和酵母菌试验组各试验菌回收率在50%-200%。若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行本产品的需氧菌总数、霉菌和酵母

4、菌总数计数。若还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，可选择回收最接近要求的方法和试验条件进行本产品的检查。4.2控制菌（大肠埃希菌）试验若检出试验菌，按本供试液制备方法和控制菌检查方法进行本品检查；若未检出试验菌，应设计新的方法消除本品的抑菌活性，并重新进行确认。5. 验证前准备5.1样品来源：浙江佐力药业股份有限公司生产。5.2培养基：购买市售所需培养基，培养基有：胰酪大豆胨琼脂培养基（北京三药），沙氏葡萄糖琼脂培养基（北京三药），胰酪大豆胨液体培养基（北京三药），麦康凯液体培养基（北京三药），麦康凯琼脂培养基（北京三药）等。5.3菌种：药检所购买。大肠埃希菌（CMCC（B）44102）、

5、枯草芽胞杆菌（CMCC(B)63501）、金黄色葡萄球菌（CMCC(B)26003）、白色念珠菌（CMCC(F)98001）、黑曲霉（CMCC(F)98003）、铜绿假单胞菌（CMCC(B)10104）。5.4仪器与试验材料：蒸汽灭菌器、净化工作台、无菌隔离舱、集菌培养器（每套3联管）、接种环、试管、刻度吸管、移液管、量筒、酒精灯、75%酒精、镊子等。5.5环境监测无菌隔离舱内及物体表面擦拭消毒，系统能正常启动并保持良好运行，尘埃粒子和沉降菌检测结果符合百级洁净级别要求。5.6参与人员已经培训并能充分理解验证方法及操作步骤。6参考文献：中国药典2015版四部通则1105、1106非无菌产品微生

6、物限度检查法7菌液制备方法7.1接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物少许至胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物少许至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035培养1824小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物少许至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，2025培养2448小时。取上述培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液，28保存，备用（注配制好的菌悬液应尽快使用，尽可能在24小时内使用）。7.2接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培斜面培养基上，2025培养57天，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，用接种环轻轻

7、将孢子洗脱。然后用一支10ml无菌球形毛细吸管，其管口用无菌纱布包扎，吸出孢子菌液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的孢子悬液，28保存，备用。7.3注意事项菌悬液配制的稀释过程中，每一级稀释液混合震荡必须充分。由于菌种为具有特殊活性的生物，菌种的状态、接种量及培养时间对最终菌悬液配制浓度都有影响，因此试验中应严格按照已确定的实验参数。制备好的原菌悬液以当天使用为宜。自我保护，防止感染。7.4菌液计数方法每次制备菌液量约100ml，将制备好的菌液充分摇匀，用灭菌移液管吸取1ml，置适宜的灭菌试管中，加PH7.0无菌氯

8、化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液9ml，然后充分摇匀，作为10-1倍稀释菌液，再从10倍稀释菌液管吸取1ml，置适宜的灭菌试管中，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液9ml，充分摇匀，作为10-2倍稀释菌液，依次稀释，制备一系列稀释菌液，将各稀释菌液取1ml，涂布于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，接种于胰酪大豆胨琼脂培养平皿中，每种菌液作平行样，3035培养1824小时，计数，取菌液浓度在小于100cfu/ml稀释级的菌液作为供试菌悬液。白色念珠菌、黑曲霉菌液取1ml分别接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平皿中，每种菌液作平行样，2025培养2448小时

9、，计数。生孢梭菌培养应在厌氧培养专用袋中培养。每稀释取样时，移液管须更换，每步稀释菌液应充分混匀，吸取体积要准确。宜选取10-410-8稀释级菌液计数。8.计数方法验证验证试验分3组，三批分次独立试验，并分别计算供试品组和对照组试验的菌回收率。8.1 供试品溶液制备取银杏叶片10g，置适宜三角瓶中，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（可适当均匀加热，温度不超过45）100ml，振摇，制成1:10供试品溶液。如需稀释时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。8.2试验组取供试品溶液1ml和适量试验菌（使每ml供试液含菌量不大于100cfu），注入直径90mm的无菌平皿中，每个平皿注入15-

10、20ml温度不超过45熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每株试验菌平行2个平皿，按平皿法测定其菌落数，以算术均值作为计数结果。胰酪大豆胨琼脂培养基培养温度3035培养3天（其中接种白色念珠菌和黑曲霉的培养5天）；沙氏葡萄糖琼脂培养基2025培养5天，计数。8.3菌液组 取稀释液代替供试液，按试验组操作加入试验菌液，对各试验菌逐一进行微生物回收试验。8.4供试品对照组 取上述供试品溶液1ml注入平皿，以稀释液代替菌液同试验组操作。8.5 回收率计算试验组菌回收率(%)=(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数) ×100%/菌液组平均菌落数9.控

11、制菌（大肠埃希菌）9.1菌液制备和计数方法同7.菌液制备方法9.2供试液的制备8.1 供试品溶液制备9.3 试验菌取供试品溶液10ml和不大于100cfu的大肠埃希菌至100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，按微生物限度检查法标准操作规程（SOP-QC-A-005）之大肠埃希菌检查法检查，在规定的温度和最短时间下培养，观察能否检出大肠埃希菌的反应特征。9.4阴性对照取相应稀释液10ml替代供试品溶液，同试验菌试验同法操作，应能检出大肠埃希菌的反应特征。10.总结与评价对验证过程及结果进行评估，评估内容包括是否严格按既定的方案组织实施，验证是否按进行了三次独立的试验，培养基的适用性检查是否进行

12、并符合要求，标准菌株管理及试验菌液的制备是否合理，任何偏差是否列入偏差分析并进行调查。11.再验证计划若检验程序或产品发生变化可能影响结果时，应重新进行方法适用性试验。文件编号：QTVRQC122-1512银杏叶片微生物限度检查法适用性试验报告报告起草方案起草人起草日期报告审核报告审核人审核日期审核日期审核日期审核日期报告批准报告批准人批准日期1验证参加人员及其职责部门姓名职责QC验证方案起草、负责实施QA负责取样，进度跟踪及信息沟通质量技术部验证方案、报告审核，负责验证组织实施、评价及偏差调查质量技术部验证方案、报告审核与批准2.概述银杏叶片是我公司生产的口服固体片剂，主要用于活血化瘀通络。

13、用于瘀血阻络引起的胸痹、心痛、中风、半身不遂、舌强语謇；冠心病稳定型心绞痛、脑梗死见上述证候者。其处方为单位处方 批生产量银杏叶提取物 40 50kg微晶纤维素 27.6 34.4kg淀粉 100.8 126kg蔗糖 20.8 26kg硬脂酸镁 0.8 1kg30%乙醇 72g 90 kg 制成 1000片 125万片主要工艺为原辅料过筛，称量，混合制粒，沸腾干燥，整粒，总混，压片，包衣，铝塑包装，外包。经前期方法确认，本品不具有抑菌性（见银杏叶片微生物方法检查验证报告编号VP-QC-026），确认检查方法为：取本品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，溶解，混匀，制成1：

14、10均匀供试液。细菌数、霉菌和酵母菌数检查：取1：10供试液按常规法检查（平皿法）。3.验证目的由于中国药典2015年版四部1100生物检查法之1105、1106非无菌产品微生物限度检查法与2010年版规定的方法和条件有所变化，现对新版药典规定的检查法适用性进行确认，以确认所采用的方法适合本产品的无菌检查。4.接受标准4.1需氧菌总数、霉菌和酵母菌试验组各试验菌回收率在50%-200%。若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行本产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。若还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，可选择回收最接近要求的方法和试验条件进行本产品的检查。4.

15、2控制菌（大肠埃希菌）试验若检出试验菌，按本供试液制备方法和控制菌检查方法进行本品检查；若未检出试验菌，应设计新的方法消除本品的抑菌活性，并重新进行确认。5. 验证前准备5.1样品来源表1 序号产品批号规格生产单位1151201总黄酮醇苷9.6mg萜类内酯2.4mg浙江佐力药业股份公司2151202总黄酮醇苷9.6mg萜类内酯2.4mg浙江佐力药业股份公司3151203总黄酮醇苷9.6mg萜类内酯2.4mg浙江佐力药业股份公司5.2培养基及适用性检查表2序号名称批号有效期至生产厂商1胰酪大豆胨液体培养基1503032018.03.02北京三药科技开发公司2沙氏葡萄糖琼脂培养基150709201

16、8.07.08北京三药科技开发公司3沙氏葡萄糖液体培养05.07北京三药科技开发公司4胰酪大豆胨琼脂培养基1509162018.09.15北京三药科技开发公司5麦康凯琼脂培养03.04北京三药科技开发公司6麦康凯液体培养基1509242018.09.23北京三药科技开发公司7PH7.0氯化钠蛋白胨-缓冲液1502112018.02.10北京三药科技开发公司上述培养基均经过培养基适用性检查方法检查且符合要。5.3标准菌种浙江省食品药品检验研究院。表3序号名称编号菌种代数来源1大肠埃希菌CMCC（B）441025浙江省食品药品检验研究院2枯草芽胞

17、杆菌CMCC(B)635013浙江省食品药品检验研究院3金黄色葡萄球菌CMCC(B)260035浙江省食品药品检验研究院4白色念珠菌CMCC(F)980013浙江省食品药品检验研究院5黑曲霉CMCC(F)980033浙江省食品药品检验研究院6铜绿假单胞菌CMCC(F)101045浙江省食品药品检验研究院5.4仪器与试验材料：主要设备情况表4序号设备名称型号状态1湿热灭菌柜MJ78A (B176)正常2生物安全柜BHC-1300A2 (B236)正常3细菌培养箱GNP-9160 (B052)正常4霉菌培养箱MJ-250-I (B094)正常5.5环境监测5.5.1微生物限度检测室检测情况表5相对

18、湿度(%)不同洁净级别相邻房间压差(Pa)消毒、灭菌情况尘埃粒子数沉降菌数符合要求10按洁净区管理制度要求进行消毒和灭菌符合D级洁净度要求符合D级洁净度要求结论符合环境要求。5.5.2阳性菌室洁净室检测情况表6相对湿度(%)不同洁净级别相邻房间压差(Pa)消毒、灭菌情况尘埃粒子数沉降菌数符合要求10按洁净区管理制度要求进行消毒和灭菌符合C级洁净度要求符合C级洁净度要求结论符合环境要求。5.5.3生物安全柜检测情况表7型号风速消毒、灭菌情况尘埃粒子数沉降菌数生物安全柜BHC-1300A2 (B236)0.35m/s按净化工作台管理制度要求进行消毒和灭菌符合A级洁净度要求符合A级洁净度要求结论符合

19、环境要求。6.6参与人员培训参与人员已经严格培养，并能正确理解验证内容及具体操作。6.7参考文献：中国药典2015版四部通则1105、1106非无菌产品微生物限度检查法7菌液制备方法7.1接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物少许至胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物少许至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035培养1824小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物少许至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，2025培养2448小时。取上述培养物用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液，28保存，备用（注配制好的菌悬液应尽快使用，尽可能在24小时内使用）。7.2接种黑

20、曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培斜面培养基上，2025培养57天，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，用接种环轻轻将孢子洗脱。然后用一支10ml无菌球形毛细吸管，其管口用无菌纱布包扎，吸出孢子菌液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的孢子悬液，28保存，备用（按12小时、24小时、48小时、72小时分别计数，考察其菌薮变化情况，确定其贮存期限）。7.3注意事项菌悬液配制的稀释过程中，每一级稀释液混合震荡必须充分。由于菌种为具有特殊活性的生物，菌种的状态、接种量及培养时间对最终菌

21、悬液配制浓度都有影响，因此试验中应严格按照已确定的实验参数。制备好的原菌悬液以当天使用为宜。自我保护，防止感染。7.4菌液计数方法每次制备菌液量约100ml，将制备好的菌液充分摇匀，用灭菌移液管吸取1ml，置适宜的灭菌试管中，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液9ml，然后充分摇匀，作为10-1倍稀释菌液，再从10倍稀释菌液管吸取1ml，置适宜的灭菌试管中，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液9ml，充分摇匀，作为10-2倍稀释菌液，依次稀释，制备一系列稀释菌液，将各稀释菌液取1ml，涂布于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，接种于胰酪

22、大豆胨琼脂培养平皿中，每种菌液作平行样，3035培养1824小时，计数，取菌液浓度在小于100cfu/ml稀释级的菌液作为供试菌悬液。白色念珠菌、黑曲霉菌液取1ml分别接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平皿中，每种菌液作平行样，2025培养2448小时，计数。生孢梭菌培养应在厌氧培养专用袋中培养。每稀释取样时，移液管须更换，每步稀释菌液应充分混匀，吸取体积要准确。宜选取10-410-8稀释级菌液计数。记录按无菌检查标准操作规程（SOPQCA-043）之菌液制备及活菌计数记录（SOP-QC-A-043-R-02）填写。记录及结果见附件。8.计数方法验证验证试验分3组，三批分次独立试验，并分别计算供试品组

23、和对照组试验的菌回收率。8.1 供试品溶液制备取银杏叶片10g，置适宜三角瓶中，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（可适当均匀加热，温度不超过45）100ml，振摇，制成1:10供试品溶液。如需稀释时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。配制记录见本微生物检查记录。附件。8.2试验组产品批号：151201试验菌枯草芽胞杆菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌铜绿假单胞菌黑曲霉平行81796571838977817668均值8068867972试验菌白色念珠菌黑曲霉平行71696468均值7066产品批号：1512.2试验菌枯草芽胞杆菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌铜绿假单胞菌黑曲霉平行768266728

24值7969808071试验菌白色念珠菌黑曲霉平行68647266均值6669产品批号：151203试验菌枯草芽胞杆菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌铜绿假单胞菌黑曲霉平行73796971847877737179均值7670817575试验菌白色念珠菌黑曲霉平行73756569均值74678.3菌液对照组产品批号：151201试验菌枯草芽胞杆菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌铜绿假单胞菌黑曲霉平行93977381919782929288均值9577949784试验菌白色念珠菌黑曲霉平行78847981均值8180产品批号：151202试验菌枯草芽胞杆菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌铜绿假单胞菌

25、黑曲霉平行91957381919782929288均值9377949784试验菌白色念珠菌黑曲霉平行85798478均值8281产品批号：151203试验菌枯草芽胞杆菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌铜绿假单胞菌黑曲霉平行91957684919783879288均值9380948584试验菌白色念珠菌黑曲霉平行87898878均值88838.4供试品对照组 供试品本底菌数。产品批 号151201151202151203需氧菌总数霉菌及酵母菌总数需氧菌总数霉菌及酵母菌总数需氧菌总数霉菌及酵母菌总数平 行000000000000均 值0000008.5 试验菌株回收率计算试验组菌回收率(%)=(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数) ×100%/菌液组平均菌落数。试验组菌回收率(%)产品批号151201151202151203平均回收率（%）枯草芽胞杆菌回收率84.284.981.783.6金黄色葡萄球菌回收率88.389.687.588.5白色念珠菌回收率需氧菌91.585.186.287.6霉菌及酵母菌86.480.584.183.7铜