第三章紫外可见分光光度法ppt课件

1、学习目的学习目的通过本章学习，为后续药物分析、中药分析课程中有通过本章学习，为后续药物分析、中药分析课程中有关药品的定性鉴别、杂质检查和含量测定的学习奠关药品的定性鉴别、杂质检查和含量测定的学习奠定基础。定基础。学习要点学习要点 紫外紫外- -可见分光光度法的基本原理；可见分光光度法的基本原理；电子跃迁类型，吸收带的类型、特点及影响因素；电子跃迁类型，吸收带的类型、特点及影响因素；Lambert-BeerLambert-Beer定律；定律；紫外紫外- -可见分光光光度计的基本构造；可见分光光光度计的基本构造；定性定量方法。定性定量方法。目 录第一节第一节 紫外紫外- -可见分光光度法的基本原理

2、可见分光光度法的基本原理第二节第二节 紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计第三节第三节 紫外紫外- -可见分光光度法分析条件的选择可见分光光度法分析条件的选择第四节第四节 紫外紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用紫 外紫 外 - 可 见 分 光 光 度 法可 见 分 光 光 度 法 ( u l t r a v i o l e t - v i s i b l e spectrophotometry，UV-Vis)是基于分子中是基于分子中价电子跃迁价电子跃迁所产生所产生的的吸收光谱吸收光谱而进行分析的方法，又称而进行分析的方法，又称紫外紫外-可见吸收光谱法可见吸收光谱法。该法波

3、长范围一般在该法波长范围一般在190800nm。特点特点：灵敏度较高，一般为灵敏度较高，一般为10-7 10-4g/ml；准确度较好，准确度较好，相对误差相对误差一般在一般在0.5%，精度高的可达，精度高的可达0.2%；仪器设备简单，操作方便，分析速度较快。仪器设备简单，操作方便，分析速度较快。概述概述一、紫外一、紫外- -可见吸收光谱可见吸收光谱（一）电子跃迁的类型（一）电子跃迁的类型1、 * 跃迁跃迁2、 * 跃迁跃迁3、 n * 跃迁跃迁4、 n * 跃迁跃迁5、电荷迁移跃迁、电荷迁移跃迁6、配位场跃迁、配位场跃迁第一节第一节 紫外紫外- -可见分光光度法的基本原理可见分光光度法的基本原

4、理电子跃迁所需能量及所处波段示意图电子跃迁所需能量及所处波段示意图*n* * n*5、电荷迁移跃迁、电荷迁移跃迁用电磁辐射照射化合物时，电子从用电磁辐射照射化合物时，电子从给与体给与体向向接受体接受体相联系的相联系的轨道轨道上跃迁称为电荷迁移跃迁。上跃迁称为电荷迁移跃迁。某些某些取代芳烃取代芳烃分子同时具有分子同时具有电子给与体电子给与体和和电子接受体电子接受体两部分，两部分，可以产生电荷转移吸收光谱。可以产生电荷转移吸收光谱。某些某些过渡金属离子过渡金属离子与与含生色团含生色团的试剂反应所产生的配合物，的试剂反应所产生的配合物，以及许多以及许多无机物离子无机物离子均可产生电荷迁移跃迁。均可产

5、生电荷迁移跃迁。此类吸收带此类吸收带较宽较宽，吸收强度大吸收强度大，一般，一般max 104。（一）电子跃迁的类型6、配位场跃迁、配位场跃迁第第4、5周期周期过渡金属水合离子过渡金属水合离子或或过渡金属离子与显色剂过渡金属离子与显色剂所形所形成的成的配合物配合物在电磁辐射作用下，吸收适当波长的紫外光或可在电磁辐射作用下，吸收适当波长的紫外光或可见光，从而获得相应的吸收光谱。见光，从而获得相应的吸收光谱。配位场跃迁吸收强度较弱，一般配位场跃迁吸收强度较弱，一般max 102。如如Ti(H2O)63+水合离子的配位场跃迁吸收带水合离子的配位场跃迁吸收带max为为490nm。大多数镧系和锕系元素离子

6、的大多数镧系和锕系元素离子的4f或或5f电子电子可发生可发生ff*跃迁跃迁（配位场跃迁），因而在紫外（配位场跃迁），因而在紫外-可见光区都有吸收。可见光区都有吸收。（一）电子跃迁的类型.8跃迁跃迁类型类型出现波段出现波段 吸收吸收强度强度化合物化合物结构结构特点特点* 200nm 弱弱 单键单键CCCH饱和烃类，对紫外无贡献，但可作饱和烃类，对紫外无贡献，但可作溶剂溶剂*200nm强强不饱和键不饱和键CCCC有共轭双键存在时，有共轭双键存在时，* 跃迁所跃迁所需能量降低，波长红移需能量降低，波长红移n*250 500nm弱弱COCN等等必须是杂原子直接连在双键上必须是杂原子直接连在双键上n*2

7、00nm弱弱COHCNH2 CSCX含有未共用电子对的基团连接在含有未共用电子对的基团连接在键上键上杂原子极性杂原子极性，红移红移杂原子数目杂原子数目，红移红移电子跃迁类型及特点电子跃迁类型及特点1、吸收光谱（吸收曲线）、吸收光谱（吸收曲线）2、生色团、生色团3、助色团、助色团4、蓝移、红移、蓝移、红移5、增色效应、减色效应、增色效应、减色效应（二）紫外（二）紫外- -可见吸收光谱中的常用术语可见吸收光谱中的常用术语1、吸收光谱（吸收曲线）、吸收光谱（吸收曲线）(1)最大吸收波长（最大吸收波长（max）吸收曲线上的吸收曲线上的最大吸收峰最大吸收峰所所对应的波长。对应的波长。(2)最小吸收波长（

8、最小吸收波长（min）吸收曲线上的吸收曲线上的最低部位的最低部位的谷谷所对应的波长。所对应的波长。(3)肩峰肩峰（sh）吸收吸收峰上峰上的的曲折处曲折处称为肩峰。称为肩峰。(4)末端吸收末端吸收在吸收曲线的在吸收曲线的最短波长处最短波长处呈呈现现强吸收强吸收而不成峰形的部分而不成峰形的部分称为末端吸收。称为末端吸收。有机化合物分子结构中含有有机化合物分子结构中含有n*、*跃迁的基团，跃迁的基团，能在紫能在紫外外-可见光范围内产生吸收的基团。可见光范围内产生吸收的基团。如如C=C、C=O、N=N等简单的双键或叁键，以及等简单的双键或叁键，以及CO、CN、CS、NO、NO2等等有杂原子渗入的双键或

9、共轭双有杂原子渗入的双键或共轭双键键。2、生色团、生色团含有含有非成键电子非成键电子的的杂原子饱和杂原子饱和基团，基团，本身不能吸收本身不能吸收波长大于波长大于200nm的辐射，但与发色团或饱和烃相连时，能使的辐射，但与发色团或饱和烃相连时，能使生色团生色团的吸的吸收峰向收峰向长波长波方向位移并方向位移并增强增强其其吸收强度吸收强度的基团。的基团。如如NH2、OH、NR2、OR、SH、SR、Cl、Br等。等。这些基团中的这些基团中的 n电子电子能能与与生色团中的生色团中的电子相互作用电子相互作用（可能产生（可能产生p-共轭），使共轭），使*跃迁跃迁能量降低能量降低，跃迁几率变大。，跃迁几率变大

10、。3、助色团、助色团(1)蓝移（紫移、短移）因化合物的结构改变或溶剂效应等引起的吸收峰向短波方向移动的现象 (2)红移（长移）因化合物的结构改变或溶剂效应等引起的吸收峰向长波方向移动的现象4、蓝移、红移、蓝移、红移(1)增色效应增色效应由于化合物的结构发生某些变化或外界因素的影响由于化合物的结构发生某些变化或外界因素的影响，使化合物的，使化合物的吸收强度增大吸收强度增大的现象的现象(2)减色效应减色效应由于化合物的结构发生某些变化或外界因素的影响由于化合物的结构发生某些变化或外界因素的影响，使化合物的，使化合物的吸收强度减小吸收强度减小的现象的现象5、增色效应、减色效应、增色效应、减色效应（三

11、）吸收带（三）吸收带依据电子跃迁和分子轨道类型，吸收带可分为依据电子跃迁和分子轨道类型，吸收带可分为：1 1、R R带带Radikal(Radikal(基团基团) )2 2、K K带带Konjugation(Konjugation(共轭作用共轭作用) ) 3 3、B B带带benzenoid(benzenoid(苯苯) ) 4 4、E E带带芳香族化合物特征吸收带芳香族化合物特征吸收带 1、R带Radikal(基团)由含由含杂原子不饱和杂原子不饱和基团（基团（ CO、NO、NO2、NN ）的的n*跃迁引起。跃迁引起。吸收峰处于较长波长范围（吸收峰处于较长波长范围（250500nm）内，吸收强度

12、）内，吸收强度中等中等（100） 。2、K带Konjugation(共轭作用) 由共轭双键中由共轭双键中 *跃迁引起。跃迁引起。吸收峰出现在吸收峰出现在200nm以上以上，吸收强度大吸收强度大（105）。）。随着共轭双键的增加，吸收峰红移，吸收强度有所增加。随着共轭双键的增加，吸收峰红移，吸收强度有所增加。如丁二烯如丁二烯max =217nm为为K带。带。3、B带benzenoid(苯) 芳香族芳香族（包括杂芳香族）（包括杂芳香族）特征吸收带特征吸收带。由苯等芳香族化合物的由苯等芳香族化合物的 *跃迁所引起的吸收带跃迁所引起的吸收带之一。之一。吸收峰出现在吸收峰出现在230270nm之间之间，

13、中心波长，中心波长256nm。在在极性溶剂极性溶剂中，中，B带精细带精细结构变得结构变得不明显或消失不明显或消失。 苯的紫外吸收光谱（异辛烷溶剂中）苯的紫外吸收光谱（异辛烷溶剂中）4、E带芳香族化合物特征吸收带 由苯环结构中由苯环结构中3个乙烯的环个乙烯的环状共轭系统的状共轭系统的 *跃迁所跃迁所引起。引起。分为分为E1和和E2两个吸收带。两个吸收带。E1吸收带约在吸收带约在184nm， max=60000 ，强吸收带。，强吸收带。E2吸收带在吸收带在204nm以上以上， max=8000 ，强吸收带。，强吸收带。 苯的紫外吸收光谱（异辛烷溶剂中）苯的紫外吸收光谱（异辛烷溶剂中）电子结构电子结

14、构化合物化合物跃迁跃迁maxmax（nmnm）maxmax吸收带吸收带乙烷乙烷* *13513510 00010 000 乙烯乙烯* *16516510 00010 000 乙炔乙炔* *17317360006000 和和n n丙酮丙酮* *约约16016016 00016 000 nn* *19419490009000 nn* *2792791515R R-CHCH2 2=CH-CH=CH=CH-CH=CH2 2* *21721721 00021 000K K-和和n nCHCH2 2=CH-CHO=CH-CHO* *21021011 50011 500K K nn* *3153151414

15、R R芳香族芳香族苯苯芳香族芳香族* *约约18018060 00060 000E E1 1 同上同上约约20020080008000E E2 2 同上同上255255215215B B一些化合物的电子结构、跃迁和吸收带.211、有机化合物的紫外吸收光谱有机化合物的紫外吸收光谱2、影响紫外吸收光谱的主要因素、影响紫外吸收光谱的主要因素（四）紫外（四）紫外- -可见吸收光谱与分子结构的关系可见吸收光谱与分子结构的关系.22(1)饱和化合物饱和化合物饱和碳氢化合物饱和碳氢化合物只有只有电子电子，因此只能产生，因此只能产生*跃迁跃迁，需要能，需要能量较大，吸收的波长通常在量较大，吸收的波长通常在15

16、0nm左右的真空紫外光区。左右的真空紫外光区。含有含有O、N、S、X等杂原子的饱和化合物，除等杂原子的饱和化合物，除电子外，还有电子外，还有n电子，可发生电子，可发生n*跃迁跃迁，在，在200nm附近有附近有弱吸收，弱吸收，通常为通常为末末端吸收。端吸收。仅少数化合物（如烷基碘）的仅少数化合物（如烷基碘）的max为为259nm（ max =400）。）。在在200400nm的近紫外区没有强吸收（常称为透明）。的近紫外区没有强吸收（常称为透明）。在紫外吸收光谱分析中在紫外吸收光谱分析中常作溶剂常作溶剂。1 1、有机化合物的紫外吸收光谱有机化合物的紫外吸收光谱.23(2)不饱和烃不饱和烃及及共轭烯

17、烃共轭烯烃含含孤立双键孤立双键或或叁键叁键的简单的简单不饱和不饱和脂肪化合物，可以产生脂肪化合物，可以产生*和和*两种跃迁。两种跃迁。最大吸收波长最大吸收波长max小于小于200nm。具有共轭体系的不饱和化合物，具有共轭体系的不饱和化合物，共轭体系越长共轭体系越长，跃迁时所需，跃迁时所需能量越小，吸收峰能量越小，吸收峰红移越显著红移越显著。如如1,3,5,7,9,11-十二烷基六烯十二烷基六烯max为为364nm，max为为138000。1 1、有机化合物的紫外吸收光谱有机化合物的紫外吸收光谱(3)羰基化合物羰基化合物羰基化合物含有羰基化合物含有C=O基团基团，可发生，可发生n*、n*和和*跃

18、迁。跃迁。其中其中n*跃迁所需要能量较低，吸收波长在近紫外光区或紫外跃迁所需要能量较低，吸收波长在近紫外光区或紫外光区，光区，为为10100。醛、酮、羧酸及其衍生物醛、酮、羧酸及其衍生物(酯、酰胺、酰卤等酯、酰胺、酰卤等)，均属于这类化，均属于这类化合物的吸收类型。合物的吸收类型。、-不饱和醛、酮，由于不饱和醛、酮，由于C=O和和C=C双键共轭双键共轭，使，使*跃迁跃迁红移至红移至200nm以上，以上，约为约为104；而；而n*跃迁跃迁红移至红移至310350nm（ 100 ）。）。如如CH2=CH- -CHO，共轭，共轭*跃迁跃迁max为为210nm，n*跃迁跃迁max为为315nm。1 1

19、、有机化合物的紫外吸收光谱有机化合物的紫外吸收光谱(4)芳香族化合物芳香族化合物苯具有环状共轭体系，在紫外光区，由苯具有环状共轭体系，在紫外光区，由*跃迁产生跃迁产生E1带、带、E2带和带和B带带3个吸收带。个吸收带。B带是芳香族化合物的特征。带是芳香族化合物的特征。当苯环上引入当苯环上引入NH2、OH、CHO、NO2基团时，苯的基团时，苯的B带带显著显著红移红移，吸收吸收强度强度增大增大。如果引入的基团如果引入的基团带有不饱和杂原子时带有不饱和杂原子时，则产生了，则产生了n*跃迁跃迁的的新吸收带。新吸收带。如硝基苯、苯甲醛的如硝基苯、苯甲醛的n*跃迁的吸收波长分别为跃迁的吸收波长分别为330

20、nm和和328nm。1 1、有机化合物的紫外吸收光谱有机化合物的紫外吸收光谱2 2、影响紫外吸收光谱的主要因素、影响紫外吸收光谱的主要因素分子的内部结构和外部环境等各种因素对吸收谱带分子的内部结构和外部环境等各种因素对吸收谱带也有一些，主要表现为也有一些，主要表现为谱带位移谱带位移、谱带强度的变化谱带强度的变化、谱带精细结构的改变谱带精细结构的改变等。等。(1)位阻影响位阻影响(2)跨环效应跨环效应(3)溶剂效应溶剂效应(4)体系体系pH值的影响值的影响(1)位阻影响位阻影响化合物中若有两个生色团产生化合物中若有两个生色团产生共轭共轭效应，可使效应，可使吸收带吸收带长移长移。但如果两个生色团由

21、于但如果两个生色团由于立体阻碍妨碍它们处于同一平立体阻碍妨碍它们处于同一平面上面上，就会影响共轭效应。，就会影响共轭效应。二苯乙烯二苯乙烯由于由于顺式结构有立体阻碍顺式结构有立体阻碍，苯环不能与乙烯，苯环不能与乙烯双键在同一平面上，不易产生共轭，因此双键在同一平面上，不易产生共轭，因此反式反式结构的结构的K带带max比顺式明显红移比顺式明显红移，且，且吸收系数吸收系数也也增加。增加。2 2、影响紫外吸收光谱的主要因素、影响紫外吸收光谱的主要因素 二苯乙烯顺式反式异构体的紫外吸收光谱二苯乙烯顺式反式异构体的紫外吸收光谱2 2、影响紫外吸收光谱的主要因素、影响紫外吸收光谱的主要因素(2) 跨环效应

22、跨环效应跨环效应指跨环效应指非共轭基团非共轭基团之间的之间的相互作用相互作用。如如对亚甲基环丁酮对亚甲基环丁酮在在214nm处出现一处出现一中等强度中等强度的的吸收带，同时吸收带，同时284nm处出现处出现R带带。这是由于结构中虽然双键与酮基不产生共轭体系这是由于结构中虽然双键与酮基不产生共轭体系，但，但适当的立体排列适当的立体排列，使羰基氧的，使羰基氧的孤电子对孤电子对与双键的与双键的电子发生作用电子发生作用，相当于，相当于n*跃迁的跃迁的R带向长波移动。带向长波移动。对亚甲基环丁酮对亚甲基环丁酮2 2、影响紫外吸收光谱的主要因素、影响紫外吸收光谱的主要因素(3)溶剂效应n* 随溶剂极性的增

23、大，吸收峰向短波移动。* 随溶剂极性的增大，吸收峰向长波移动。 极性溶剂对两种跃迁能级差的影响示意图极性溶剂对两种跃迁能级差的影响示意图2 2、影响紫外吸收光谱的主要因素、影响紫外吸收光谱的主要因素溶剂极性对异丙叉丙酮的两种跃迁吸收峰的影响溶剂极性对异丙叉丙酮的两种跃迁吸收峰的影响跃迁类型跃迁类型正己烷正己烷三氯甲烷三氯甲烷甲醇甲醇水水* * 230nm230nm238nm238nm237nm 237nm 243nm243nmnn* *329nm329nm315nm315nm309nm309nm305nm305nm 对称四嗪的吸收光谱对称四嗪的吸收光谱a. a. 蒸气态中蒸气态中 b. b.

24、环己烷中环己烷中 c. c. 水中水中极性溶剂极性溶剂往往使吸收峰的往往使吸收峰的精细结构消失精细结构消失2 2、影响紫外吸收光谱的主要因素、影响紫外吸收光谱的主要因素(4)体系体系pH值的影响值的影响体系酸碱度对体系酸碱度对酸碱性有机化合物酸碱性有机化合物吸收光谱的影响吸收光谱的影响普遍存在。普遍存在。如如酚类酚类化合物由于体系化合物由于体系pH值不同，其值不同，其解离情况解离情况不同不同，而产生不同的吸收光谱。，而产生不同的吸收光谱。OHOHHOmax 210.5nm（max 6200） 236nm（max 9400） 270nm （max 1450） 287nm（max 2600）2 2

25、、影响紫外吸收光谱的主要因素、影响紫外吸收光谱的主要因素二、朗伯二、朗伯- -比尔定律比尔定律朗伯朗伯-比尔定律比尔定律(Lambert-Beer)是光吸收的基本定律，是分光光度法定量是光吸收的基本定律，是分光光度法定量分析的依据和基础。分析的依据和基础。如果浓度如果浓度c以以物质的量浓度物质的量浓度（mol/L）表示，则公式可以写成）表示，则公式可以写成 其中其中称为称为摩尔吸收系数摩尔吸收系数，单位为，单位为L/（molcm）。）。如果浓度如果浓度c以以质量百分浓度质量百分浓度（g/100ml）表示，则公式可以写成）表示，则公式可以写成 其中称为其中称为百分吸收系数百分吸收系数，单位为，单

26、位为100ml/（gcm）。）。吸收系数两种表示方式之间的关系是：吸收系数两种表示方式之间的关系是：lgATElc cAl1%1cmAElc%1110cmEM（一）数学表达式及物理意义（一）数学表达式及物理意义例例 某种从中药提取物分离纯化制得的有效成分，浓度为某种从中药提取物分离纯化制得的有效成分，浓度为12.6g/ml，用，用1cm吸收池，在最大吸收波长吸收池，在最大吸收波长238nm处测得其吸处测得其吸光度为光度为0.437，试计算其，试计算其 （max ）；若该组分的分子量是）；若该组分的分子量是264，计算其，计算其（max ）。）。解：已知解：已知c=12.6g/ml=12.610

27、-6100=1.2610-3 (g/100ml)朗伯朗伯- -比尔定律公式运用比尔定律公式运用%11cmE1%21max30.437()3.47 101.26 101cmAEcl32%11max1016. 91047. 31026410)(cmEM1 1、化学、化学因素因素2 2、光学、光学因素（非单色光，杂散光，散射光和反射光因素（非单色光，杂散光，散射光和反射光，非平行光），非平行光）（二）偏离朗伯（二）偏离朗伯-比尔定律的因素比尔定律的因素吸光物质可因浓度的改变而发生吸光物质可因浓度的改变而发生离解离解、缔合缔合、溶剂化溶剂化以及以及配合配合物生成物生成等变化，使吸光物质的等变化，使吸光

28、物质的存在形式存在形式发生变化，从而偏离朗发生变化，从而偏离朗伯伯-比尔定律。比尔定律。 C6H5COOHH2O = C6H5COOH3O max（nm) 273 268max L/(molcm) 970 560稀释稀释溶液或溶液或改变改变溶液溶液pH值时，吸收波长及吸收系数都会改变。值时，吸收波长及吸收系数都会改变。1 1、化学因素、化学因素2 2、光学因素、光学因素(1)非单色光非单色光(2)杂散光杂散光 (3)散射光和反射光散射光和反射光(4)非平行光非平行光(1)非单色光非单色光比尔定律比尔定律只适用于只适用于单色光单色光，实际用于测量的都是具有一定，实际用于测量的都是具有一定谱带谱带

29、宽度宽度的复合光，谱带宽度的复合光，谱带宽度越小越小，单色性越好。，单色性越好。谱带宽度谱带宽度应选择曲线较为平坦应选择曲线较为平坦的最大吸收波长的最大吸收波长a a处测定处测定2 2、光学因素、光学因素2 2、光学因素、光学因素(2)杂散光杂散光 从单色器得到的单色光中，还有一些从单色器得到的单色光中，还有一些不在谱带范围不在谱带范围内的内的、与所需波长、与所需波长相隔甚远相隔甚远的光，称为杂散光。的光，称为杂散光。它是由于仪器光学系统的它是由于仪器光学系统的缺陷缺陷或光学元件或光学元件受灰尘受灰尘、霉蚀霉蚀的影响而引起的。的影响而引起的。在透光率很弱时，杂散光会产生明显的作用。在透光率很弱

30、时，杂散光会产生明显的作用。在接近在接近紫外末端吸收紫外末端吸收处，杂散光的处，杂散光的比例相对增大比例相对增大，从而，从而干扰测定，有时还会出现干扰测定，有时还会出现假峰假峰。2 2、光学因素、光学因素(3)散射光和反射光散射光和反射光吸光质点吸光质点对入射光有对入射光有散射散射作用，吸收池内外界面之作用，吸收池内外界面之间入射光通过时会有反射作用。间入射光通过时会有反射作用。散射和反射作用致使透射光强度减弱。散射和反射作用致使透射光强度减弱。真溶液真溶液散射作用较弱，可用空白进行补偿。散射作用较弱，可用空白进行补偿。混浊溶液散射作用较强，影响结果测定，故要求被混浊溶液散射作用较强，影响结果

31、测定，故要求被测溶液为测溶液为澄清溶液澄清溶液。2 2、光学因素、光学因素(4)非平行光非平行光倾斜光通过吸收池的倾斜光通过吸收池的实际光程实际光程将比垂直照射的平行将比垂直照射的平行光的光程光的光程长长，使，使吸光度增加吸光度增加，影响测量值。，影响测量值。透光率测量误差（透光率测量误差（T）来自仪器的）来自仪器的噪声。噪声。浓度测量结果的浓度测量结果的相对误差（相对误差（c/c）与与透光率测量误差关系透光率测量误差关系可由朗伯可由朗伯-比比尔定律导出：尔定律导出：浓度测量的相对误差取决于浓度测量的相对误差取决于透光率透光率T和和透光率测量误差透光率测量误差T的大小。的大小。0 .4 3 4

32、lgcTcTT相对误差与透光率的关系相对误差与透光率的关系（三）透光率测量误差（三）透光率测量误差一、主要部件一、主要部件光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器信号显示系统信号显示系统第二节第二节 紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计（一）光源光源的作用是提供激发能，使待测分子产生吸收。光源的作用是提供激发能，使待测分子产生吸收。1 1、光源的要求光源的要求 发射发射连续辐射连续辐射光；光；有足够的有足够的辐射强度辐射强度及良好的及良好的稳定性稳定性；辐射强度随波长的辐射强度随波长的变化变化应尽可能应尽可能小小；光源的使用光源的使用寿命长寿命长，操作方便。，操作方便。（一）光源2、

33、光源的种类光源的种类 常用的光源有常用的光源有热辐射光源热辐射光源（如（如钨灯钨灯、卤钨灯卤钨灯）和和气体放电光源气体放电光源（如如氢灯氢灯和和氘灯氘灯）两类。两类。(1)钨灯和碘钨灯：钨灯和碘钨灯：3402500nm，可见光区内辐射强度与工作，可见光区内辐射强度与工作电压的电压的4次方成正比。次方成正比。(2)氢灯和氘灯：氢灯和氘灯：160375nm，氘灯比同功率的氢灯光强度大，氘灯比同功率的氢灯光强度大35倍。倍。(3)激光紫外光源：激光紫外光源：高强度、高单色性高强度、高单色性，氩离子激光器、可调，氩离子激光器、可调谐染料激光器。谐染料激光器。单色器是从光源的复合光中分出单色器是从光源的

34、复合光中分出单色光单色光的光学装置，其主要特的光学装置，其主要特点是产生点是产生光谱纯度高光谱纯度高、色散率高且波长可调节。、色散率高且波长可调节。由由进光狭缝进光狭缝、准直镜准直镜、色散元件色散元件、聚焦元件聚焦元件和和出光狭缝出光狭缝等几个等几个部分组成，核心部件是色散元件。部分组成，核心部件是色散元件。（二）单色器（二）单色器 单色器光路示意图单色器光路示意图棱镜色散与光栅色散棱镜色散与光栅色散（二）单色器（二）单色器1、色散元件、色散元件(1)棱镜：利用折射率差别制成。棱镜：利用折射率差别制成。(2)光栅：利用光的衍射与干涉作用制成。光栅：利用光的衍射与干涉作用制成。每每1mm玻璃上刻

35、玻璃上刻6001200条槽。条槽。每条刻线相当于每条刻线相当于1条狭缝，光在未刻部分发条狭缝，光在未刻部分发生反射，各反射光束间的干涉引起色散。生反射，各反射光束间的干涉引起色散。（二）单色器（二）单色器2、准直镜、准直镜以以狭缝狭缝为为焦点焦点的的聚光镜聚光镜。将进入单色器的将进入单色器的发射光发射光变成变成平行光平行光；将色散后的平行单色光将色散后的平行单色光聚集聚集于于出光狭缝出光狭缝。（二）单色器（二）单色器3、狭缝、狭缝狭缝狭缝宽度直接影响单色光的纯度。宽度直接影响单色光的纯度。狭缝狭缝过宽过宽，单色光，单色光不纯不纯；狭缝；狭缝过窄过窄，光通量过小光通量过小，灵敏度降低。，灵敏度降

36、低。定性定性分析宜采用分析宜采用较小较小的狭缝宽度。的狭缝宽度。定量定量分析宜采用分析宜采用较大较大的狭缝宽度。的狭缝宽度。（二）单色器（二）单色器4、杂散光及其消除、杂散光及其消除杂散光：杂散光：指出射光束指出射光束中中混有混有的的与与仪器所仪器所指示指示的的波长相差较大波长相差较大的光的光波。波。杂散光会严重影响吸光度测定。杂散光会严重影响吸光度测定。杂散光产生的杂散光产生的原因原因：各光学部件和单色器的外壳内壁的：各光学部件和单色器的外壳内壁的反射反射；大；大气或化学部件表面尘埃的气或化学部件表面尘埃的散射散射；光学元件；光学元件霉变、腐蚀霉变、腐蚀。可将单色器用罩壳可将单色器用罩壳封闭

37、封闭起来，罩壳内起来，罩壳内涂涂有有黑体黑体以吸收杂散光。以吸收杂散光。即比色皿，用于盛放待测溶液的容器。1、光学玻璃吸收池 可见光区2、熔融石英吸收池 可见光区、紫外光区用于盛放供试液和参比液的比色皿，应厚度相同，两只比色皿的透光率之差小于0.5%。（三）吸收池将光信号转变成电信号的光电转换元件，其产生的电信号与照射光强度成正比。要求：在测量范围内具有高灵敏度；对辐射能量的响应快、线性关系好、线性范围宽；对不同波长的辐射影响性能相同且可靠；稳定性好，噪声水平低。（四）检测器1、光电池2、光电管3、光电倍增管4、光二极管阵列检测器（四）检测器1、光电池硒光电池：敏感光区300800nm，易疲劳

38、，寿命短。硅光电池：紫外光区及可见光区。（四）检测器2、光电管以一弯成半圆柱形的金属片为阴极，阴极内表面镀有碱金属或碱金属氧化物等光敏层；在圆柱形的中心置一金属丝为阳极，可接受阴极释放的电子。两电极密封于玻璃管或石英管内并抽真空。红敏光电管(镀有银和氧化铯)可用于6251000nm波长。蓝敏光电管(镀有锑和铯)可用于200625nm波长。光电管灵敏度高，光敏范围宽，不易疲劳。（四）检测器 光电管检测器示意图光电管检测器示意图3、光电倍增管一种加上多级倍增电极的光电管。外壳由玻璃或石英制成，阴极表面涂有光敏物质，在阴极与阳极之间装有一系列次级电子发射极，即电子倍增极。辐射光子撞击阴极时发射光电子

39、，该电子被电场加速并撞击第一倍增极，撞出更多电子，依次进行，最后阳极收集到的电子数是阴极发射电子的105106倍。（四）检测器 光电倍增管示意图光电倍增管示意图光电管输出的电信号很弱，需经过放大才能以某种方式将测量结果显示出来，一般的分光光度计多具有荧屏显示、结果打印及吸收曲线扫描等功能。现代的分光光度计装备有计算机光谱工作站，可对数字信号进行采集、处理与显示，并对各系统进行自动控制。（五）信号处理和显示系统1 1、单光束分光光度计、单光束分光光度计2 2、双光束分光光度计、双光束分光光度计3 3、双波长分光光度计、双波长分光光度计4 4、全波长分光光度计、全波长分光光度计二、分光光度计的类型

40、在单光束光学系统中，单色器色散后的在单光束光学系统中，单色器色散后的单色光单色光进入进入吸吸收池收池。经单色器分光后形成一束经单色器分光后形成一束平行光平行光，轮流通过轮流通过参比溶液参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。和样品溶液，以进行吸光度的测定。这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，维修容这种简易型分光光度计结构简单，操作方便，维修容易，适用于易，适用于常规分析常规分析。（一）单光束分光光度计光源发出光经光源发出光经单色器单色器分光后，经分光后，经旋转旋转扇面镜（扇面镜（切光器切光器）分为强度）分为强度相等的相等的两束光两束光，一束通过参比池，另一束通过样品池，光度计能，一束通过参

41、比池，另一束通过样品池，光度计能自动自动比较比较两束光的两束光的强度强度，此比值即为试样的，此比值即为试样的透射比透射比，经对数变换，经对数变换将它转换成将它转换成吸光度吸光度，并作为波长函数记录下来。，并作为波长函数记录下来。双光束分光光度计一般都能双光束分光光度计一般都能自动记录自动记录吸收光谱曲线。吸收光谱曲线。由于两束光同时分别通过参比池和样品池，因而能由于两束光同时分别通过参比池和样品池，因而能自动消除光源自动消除光源强度变化强度变化所所引起引起的的误差误差。（二）双光束分光光度计由由同一光源同一光源发出的光被发出的光被分为两束分为两束，分别经过两个，分别经过两个单色器单色器，得，得

42、到两束到两束不同波长不同波长的的单色光单色光。利用切光器使两束光以一定频率利用切光器使两束光以一定频率交替照射同一吸收池交替照射同一吸收池，然后，然后测定两个波长处的测定两个波长处的吸光度差值吸光度差值A A。A= A1 A2=(1 2)lc（三）双波长分光光度计优点：优点：双波长分光光度计只利用双波长分光光度计只利用1个吸收池个吸收池，消除了吸收池及参比池，消除了吸收池及参比池所引起的测量误差；所引起的测量误差；用用同一光源同一光源得到两束光，可减小因光源电压变化产生的影响。得到两束光，可减小因光源电压变化产生的影响。（三）双波长分光光度计光电二极管阵列（光电二极管阵列（PDAPDA）是在）

43、是在晶晶体硅体硅上紧密排列一系列上紧密排列一系列光电二极光电二极管检测管管检测管，光经，光经全息光栅全息光栅表面色表面色散并透射到二极管阵列检测器上散并透射到二极管阵列检测器上，被其中的光二极管接受。，被其中的光二极管接受。二极管输出的电信号强度与光强二极管输出的电信号强度与光强度成正比。度成正比。两个二极管两个二极管中心距离的波长单位中心距离的波长单位称为称为采样间隔采样间隔。二极管数目越多，分辨率越高。二极管数目越多，分辨率越高。（四）全波长分光光度计全波长分光光度计全波长分光光度计同时检测同时检测透过透过样品样品复色光复色光。它具有它具有灵敏度高灵敏度高、噪音低噪音低、线性线性范围宽范围

44、宽等优点，可用作高效液相等优点，可用作高效液相色谱检测器。色谱检测器。（四）全波长分光光度计（一）光学性能（一）光学性能1 1、辐射波长、辐射波长2 2、仪器的测量范围、仪器的测量范围3 3、仪器的重复性及准确度、仪器的重复性及准确度4 4、杂散光、杂散光三、光学性能与仪器校正1、辐射波长、辐射波长(1)波长范围：指仪器所波长范围：指仪器所能测量能测量的波长范围，通常为的波长范围，通常为200800nm。(2)光谱带宽：指在光谱带宽：指在最大透光强度一半处最大透光强度一半处曲线的曲线的宽度，宽度，通常为通常为6nm以下。以下。(3)波长准确度波长准确度：仪器所：仪器所显示显示的的波长波长数值与

45、单色光的数值与单色光的实际波长实际波长值之值之间的间的误差误差，规定，规定紫外紫外光区光区1nm，500nm附近附近2nm。(4)波长重复性：重复使用同一波长，单色光实际波长的变动值，波长重复性：重复使用同一波长，单色光实际波长的变动值，通常通常1nm。三、光学性能与仪器校正2、仪器的测量范围、仪器的测量范围透光率表示：透光率表示：-1.0%200.0%吸光度表示：吸光度表示：-0.5A3.000A3、仪器的重复性及准确度、仪器的重复性及准确度光度重复性：指光度重复性：指同样情况同样情况下重复测量透光率的下重复测量透光率的变动变动，通常，通常0.5%。光度准确度：指以透光率测量值的误差表示。透

46、光率满量程误差光度准确度：指以透光率测量值的误差表示。透光率满量程误差为为0.5%（铬酸钾溶液）（铬酸钾溶液）三、光学性能与仪器校正4、杂散光、杂散光通常以通常以测光信号较弱测光信号较弱的波长处所含杂散光的的波长处所含杂散光的强度百分比强度百分比为指标。为指标。药典规定：药典规定：220nm处处NaI（1g/100ml）透光率）透光率0.8%，340nm处处Na2NO2（5g/100ml）透光率）透光率0.8%。三、光学性能与仪器校正1、波长的校正 常用汞灯（237.83nm、253.65 nm等）或氘灯（486.02 nm、656.10nm）中的较强谱线进行校正。高氯酸钬溶液校正双光束仪器。

47、2、吸光度的校正 使用重铬酸钾的硫酸溶液，在规定的波长处测定并计算其吸收系数，并与规定的吸收系数比较，来检定分光光度计吸光度的准确度。3、杂散光的检查 测定规定浓度的碘化钠或亚硝酸钠溶液在规定波长处的透光率来进行检查。（二）仪器校正一、检测波长的选择1、定量分析中，测定波长一般选择在被测组分最大吸收波长处。2、如果被测组分有几个最大吸收波长时，可选择不易出现干扰吸收、吸光度较大而且峰顶比较平坦的最大吸收波长。3、若干扰物质在最大吸收波长处有较强的吸收，可选用非最大吸收处的波长。第三节第三节 紫外紫外- -可见分光光度法分析条件的选择可见分光光度法分析条件的选择所选择的溶剂应易于溶解样品而不与样

48、品发生作用，且在测定波长区间内吸收小，不易挥发。常用溶剂的截止波长二、溶剂的选择溶溶 剂剂截止波长（截止波长（nm）溶溶 剂剂截止波长（截止波长（nm）水水200 环己烷环己烷200 乙乙 腈腈210 正己烷正己烷220 95%乙醇乙醇210 二氯甲烷二氯甲烷235 乙乙 醚醚210 三氯甲烷三氯甲烷245 异丙醇异丙醇210 四氯化碳四氯化碳265 正丁醇正丁醇210 苯苯280 甲甲 醇醇215 丙丙 酮酮330 1、溶剂参比 当试样组成较为简单，共存组分很少且在测定波长吸收极小，以及显色剂没有吸收，可采用纯溶剂作为参比溶液。可消除溶剂、吸收池等因素的影响。三、参比溶液的选择2、试剂参比如

49、果显色剂或其他试剂在测定波长有吸收，按显色反应相同的条件，不加入试样溶液，同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。可消除试剂中组分所产生吸收的影响。三、参比溶液的选择3、试样参比如果试样基体（除被测组分外的其他共存组分）在测定波长处有吸收，而与显色剂不起显色反应时，可不加显色剂但按与显色反应相同的条件处理试样，作为参比溶液。适用于试样中有较多的共存组分，加入的显色剂量较少，且显色剂在测定波长无吸收。三、参比溶液的选择通过调节待测溶液的浓度和吸收池的厚度来调节通过调节待测溶液的浓度和吸收池的厚度来调节A值，使其在值，使其在0.20.7之间。之间。0 .4 3 4lgcTcTT四、溶液吸光度的范围及测定对

50、于对于不能产生不能产生吸收的物质吸收的物质或者或者吸收系数很小吸收系数很小的物质，可选用的物质，可选用适适当的试剂当的试剂与被测物质定量反应，与被测物质定量反应，生成生成对紫外或可见光对紫外或可见光有较大吸有较大吸收收的物质再进行测定。的物质再进行测定。（一）显色反应要求（一）显色反应要求（二）显色条件的选择（二）显色条件的选择五、显色反应及显色条件的选择（一）显色反应要求1、被测物质和所生成的有色物质之间必须有、被测物质和所生成的有色物质之间必须有确定确定的的计量关系计量关系；2、反应产物必须有、反应产物必须有较高较高的的吸光能力吸光能力（103105）和足够的）和足够的稳定性稳定性；3、反

51、应产物的、反应产物的颜色颜色与显色剂的颜色必须与显色剂的颜色必须有有明显的明显的差别差别；4、显色反应必须有、显色反应必须有较好较好的的选择性选择性，以减免干扰。，以减免干扰。1 1、显色剂用量、显色剂用量2 2、溶液酸碱度、溶液酸碱度3 3、显色时间、显色时间4 4、温度、温度5 5、溶剂、溶剂（二）显色条件的选择显色剂用量可通过实验选择，在显色剂用量可通过实验选择，在固定金属离子浓度固定金属离子浓度的情的情况下，作况下，作吸光度吸光度A随随显色浓度显色浓度c的变化曲线，选取的变化曲线，选取吸光度恒定吸光度恒定时时的显色剂用量。的显色剂用量。1、显色剂用量酸碱度对显色反应影响极大。酸碱度对显

52、色反应影响极大。如如FeFe3+3+与与水杨酸水杨酸的配合物，组成随介质的配合物，组成随介质pHpH值的不同而变化。值的不同而变化。pH值范围值范围 络合物组成络合物组成 颜颜 色色 1.84 Fe(C7H4O3)+ 紫红色紫红色 47 Fe(C7H4O3)2- 棕褐色棕褐色 810 Fe(C7H4O3)33- 黄色黄色合适的合适的pH值可以通过绘制值可以通过绘制A-pH曲线来确定。曲线来确定。 选择平坦处对选择平坦处对应应pH值值2、溶液酸碱度、溶液酸碱度由于各种显色反应的速度不同，且介质酸度、显色剂的浓度都将会影响显色时间。必须固定其他显色条件，通过实验作出A-t曲线，才能确定适宜的显色时

53、间和测定时间。3、显色时间显色反应须在适当温度下进行。一般的显色反应也可以在室温下进行。4、温度溶液的性质可直接影响被测物质对光的吸收，且显色反应产物的稳定性也与溶剂有关。苦味酸在水溶液中呈黄色，在三氯甲烷在呈无色。硫氰酸铁红色配合物在丁醇中比在水溶液中稳定。5、溶剂溶溶 剂剂截止波长（截止波长（nm）溶溶 剂剂截止波长（截止波长（nm）水水200 环己烷环己烷200 乙乙 腈腈210 正己烷正己烷220 95%乙醇乙醇210 二氯甲烷二氯甲烷235 乙乙 醚醚210 三氯甲烷三氯甲烷245 异丙醇异丙醇210 四氯化碳四氯化碳265 正丁醇正丁醇210 苯苯280 甲甲 醇醇215 丙丙 酮

54、酮330 第四节第四节 紫外紫外- -可见分光光度法的应用可见分光光度法的应用一、定性分析一、定性分析二、纯度检查二、纯度检查三、定量分析三、定量分析四、结构分析四、结构分析五、应用与示例五、应用与示例利用紫外吸收光谱的形状、吸收峰的数目、各吸收峰的波长利用紫外吸收光谱的形状、吸收峰的数目、各吸收峰的波长和相应的吸收系数等可对部分有机化合物进行定性鉴别。和相应的吸收系数等可对部分有机化合物进行定性鉴别。3.3.吸收峰的数目吸收峰的数目1. 1.吸收光谱形状吸收光谱形状2.2.各吸收峰的波长各吸收峰的波长4.4.相应波长处的吸收系数相应波长处的吸收系数一、定性分析一、定性分析定性分析方法：定性分

55、析方法：对比法对比法1、比较吸收光谱的一致性、比较吸收光谱的一致性两个两个相同化合物相同化合物，在同一条件下测定其，在同一条件下测定其吸收光谱吸收光谱应应完全一致完全一致。一、定性分析一、定性分析例例 安宫黄体酮安宫黄体酮和和炔诺酮炔诺酮分子中都存在分子中都存在、-不饱和羰基的不饱和羰基的特征吸收结构，最大特征吸收结构，最大吸收波长相同吸收波长相同但但相对分子量不同相对分子量不同，有明，有明显差异，可用于鉴别。显差异，可用于鉴别。OCH3CH3HHHCH3CH3OCOCH3COOHHHCH3OHCCH安宫黄体酮（安宫黄体酮（M386.53） 炔诺酮（炔诺酮（M= 298.43） max2401

56、nm max2401nm 4081%1cmE 5711%1cmE2 2、比较吸收光谱的特征数据、比较吸收光谱的特征数据一、定性分析一、定性分析3、比较吸光度（或吸收系数）比值、比较吸光度（或吸收系数）比值有多个吸收峰的化合物，可利用在有多个吸收峰的化合物，可利用在不同吸收峰不同吸收峰（或峰与谷）处（或峰与谷）处测得吸光度的测得吸光度的比值比值A1/A2或或1/2作为鉴别的依据。作为鉴别的依据。例例 中国药典中国药典（2019年版）对年版）对叶酸叶酸采用下述方法鉴别：将检采用下述方法鉴别：将检品按规定方法配成品按规定方法配成10g/ml的溶液，分别测定的溶液，分别测定256nm和和365nm处处

57、的吸光度，两者比值应为的吸光度，两者比值应为2.83.0。一、定性分析一、定性分析二、纯度检查二、纯度检查1、杂质检查、杂质检查 利用试样与所含杂质在紫外利用试样与所含杂质在紫外-可见光区吸收的差异。可见光区吸收的差异。2、杂质的限量检测 药物地蒽酚中常有其制备的原料和氧化分解产物二羟基蒽醌。在三氯甲烷溶液中两者的紫外吸收光谱有显著差异，中国药典（2019年版）规定，0.01%的地蒽酚三氯甲烷溶液用1cm吸收池在432nm处测定，吸光度不得大于0.12，即相当于含二羟基蒽醌的含量不大于2.0%。 OOHOHOOHOHO地蒽酚二羟基蒽醌地蒽酚和二羟基蒽醌的紫外吸收光谱地蒽酚和二羟基蒽醌的紫外吸收

58、光谱二、纯度检查二、纯度检查（一）单组分样品的定量分析（一）单组分样品的定量分析（二）多组分样品的定量分析（二）多组分样品的定量分析三、定量分析1、单组分样品定量分析的条件 在一个试样中只要测定一种组分，且在选定的测量波长下，试样中其它组分对该组分不干扰。2、单组分样品定量分析的方法（1）吸收系数法（2）标准曲线法（3）标准对照法（一）单组分样品的定量分析（1）吸光系数法）吸光系数法根据根据Beer定律，若定律，若l和吸收系数和吸收系数或或 已知，即可根据已知，即可根据供试品溶液测得的供试品溶液测得的A值值求出被测组分的浓度。求出被测组分的浓度。1%1cmE1%1cmAAclEl（一）单组分样

59、品的定量分析例例 维生素维生素B B1212的水溶液在的水溶液在361nm361nm处的处的 值是值是207207，盛于，盛于1cm1cm吸收池中，测得溶液的吸光度为吸收池中，测得溶液的吸光度为0.6210.621，则溶液浓度为：，则溶液浓度为： c = 0.621/(207 c = 0.621/(2071)=0.00300 (g/100ml)1)=0.00300 (g/100ml)注意：用注意：用 ， 则则c c单位为单位为g/100mlg/100ml；用；用，则则c c单位为单位为mol/Lmol/L。1%1cmE1%1cmE（2 2）标准曲线法）标准曲线法先配制先配制一系列一系列不同浓度

60、的不同浓度的标准溶液标准溶液，以不含被测组分的，以不含被测组分的空白溶空白溶液作参比液作参比，测定系列标准溶液的吸光度，绘制，测定系列标准溶液的吸光度，绘制吸光度吸光度- -浓度曲线浓度曲线，称为标准曲线，进而拟合出称为标准曲线，进而拟合出回归方程回归方程。在相同的条件下在相同的条件下测定测定试样溶液的试样溶液的吸光度吸光度，从标准曲线山找出对，从标准曲线山找出对应的浓度，或者从回归方程应的浓度，或者从回归方程求出求出被测组分被测组分浓度浓度。（一）单组分样品的定量分析（3 3）标准对照法）标准对照法在在相同条件相同条件下配制下配制标准溶液标准溶液和和供试品供试品溶液，在选定波长处，溶液，在选