单克隆抗体制备操作方法及注意事项JEN

1、无菌室清洁要求：1、进入无菌间，须更换白大褂，口罩、鞋套必须戴上，最好戴上帽子、手套；2、进去后用酒精棉球擦洗手；3、生物安全柜常用酒精棉球擦洗，擦后棉球不显黑；柜内垃圾当日及时清理；柜内所有实验操作应在酒精灯前进行；经常紫外杀菌；4、无菌间物件传递，经窗口紫外照射方可；5、有关试剂使用后及时用封口膜封住；6、细胞培养盖子旋松，以便二氧化碳气体进入；拿瓶、加液体均需注意瓶口，避免污染瓶盖；7、出门后需要用钥匙锁上；8、整个无菌间两周清洁一次；免疫动物：选择与瘤细胞同一品系的动物做为免疫对象，现在常用的是Balbc/c小鼠，6-8周龄，一种抗原一次性注射 2-3只小鼠，小鼠不宜过大，雌性相对较

2、好；首次注射抗原100微克与等体积弗氏完全佐剂混匀，在背部两侧皮下与腹腔分别 注射，形成几个小泡；间隔两周左右时间（14天）二次免疫注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，通常上次背部小泡仍然存在；间隔两周左右时间（14天）三免小鼠注射抗原50微克与等体积弗氏不完全佐剂混匀，在背部皮下及腹腔分别注射，通常上次背部小泡仍然存在；间隔7-10天左右时间尾部采血测定抗体效价：方法一：手拇指和食指从背部抓住小鼠颈部皮肤，将小鼠头朝下，小鼠保定后将其尾巴置于50°热水中浸泡数分钟，使尾部血管充盈。擦干尾部，再用剪刀或 刀片剪去尾尖12mm用试管接流出的血液，同时自

3、尾根部向尾尖按摩。取血 后用棉球压迫止血并用6喊体火棉胶涂在伤口处止血。每次采血量 0.1ml。方法二：固定小鼠，一人捏住小鼠耳朵固定小鼠，同时抓住尾梢协助取血，另一 个人左手捏住小鼠尾巴根部，右手用酒精棉球擦洗，使尾部血管充盈，食指抵住 尾巴，用一次性1ml注射器穿刺血管，用10微升移液枪及时吸取全血2.5微升， 加在盛有97.5微升的PB飒冲液中稀释10倍，再稀释一百倍，之后做倍比稀释 测定效价，读数到阴性血清值的2.1倍，合理效价应高于12.8万倍。实际操作显示，采血使用剪尾方法较好，一人固定小鼠，另一人直接在尾端剪掉 1-2mm从尾根部向尾尖部按摩，在尾端可见一滴血，吸取2.0微升加在

4、2ml的PBS容液中，直接稀释1000倍，混匀，再倍比稀释测定效价；当日或次日，对全血用生理盐水进行倍比稀释，测定抗体效价，效价未达到规范， 则继续进行常规免疫，效价达到规范，则选择效价最高的一只小鼠作为脾细胞源 鼠，并在细胞融合三天前尾静脉注射加强免疫。随后，取冻存好的瘤细胞进行复苏、培养、扩瓶，直到单只小鼠细胞融合需要稳 定良好生长瘤细胞培养液约为 120ml （大约一周可以完成），之后可进行细胞融合实验；在细胞融合三天前（72-96小时），直接尾部静脉注射50微克抗原加强免疫； 先用烧杯固定小鼠露出尾巴，用温水（水温约50度左右）泡大约2分钟，这样能使血管充分舒张。用干棉球擦干；用1毫升

5、注射器选择两侧较浅的静脉穿刺注 射抗原，位置选择尾部中下2/31/2处比较好 从下向上扎，万一一次扎不进，还 可以继续使用此血管。具体操作是左手食指和中指上下夹注你所选择血管的靠近 身体的一边，无名指和小指垫起一块纱布或者纸巾（建立一个穿刺的平面的作用）， 拇指压住所选血管的尾尖端，上下夹住血管的距离应以不影响右手持针上下移动 为宜.（否则容易人为建立穿刺的角度，而使右手持穿刺针穿刺过深，导致穿刺失败.） 右手持穿刺针，稍微挑起皮肤一点，就可以平着进针，看到回血表明成功，还可以回 抽，见到回血后表明穿刺已进入血管，可以给药.穿刺结束后，用纱布压住穿刺部位 反折尾部进行止血.良好并彻底的止血对于

6、血管可以起到很好的保护作用，这对于需要天天穿刺给药是非常有用的（一般小鼠需要按压时间很长，否则易引起出 血）。如果尾部静脉注射未能成功，则进行腹腔注射。瘤细胞饲养骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系， 这样杂交融合率高，也便于接种杂交 瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量 McAb常用骨髓瘤细胞系有：NS1 SP2 /0、X63 Ag8.653等。细胞的最大密度不得超106/ml, 一般扩大培养以1 ：4 或6进行稀释彳代，每35天可传代一次。上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或 轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。1、显微镜观察细胞形态，呈较亮表明细胞生长良好，反之颜色较深，可见一些 小

7、黑点，可能细胞已大部分死亡；2、状态良好，装入二氧化碳培养箱静置培养 37C, 5%二氧化碳浓度，T25细胞 培养瓶培养液可加15ml含10-20%的灭火小牛血清DMEM培养基进行培养 （酒精擦洗，有菌及时擦洗，常规一月一次，常开）3、每日显微镜观察细胞状态，贴壁较多（细胞挤在一起几乎无空白区域）或培 养液颜色变黄换液（倒出上清液，加新鲜培养液大体盖住底部，细胞过多在 加新鲜培养基前吹打）一般3-5可重新长满4、换液2-3次5、生长稳定后，扩瓶，先1:4 （细胞液：新鲜培养基）扩瓶，之后可适当增大比 例，扩增到自己需要的培养液；6、冻存，取生长良好的细胞液，吹打混匀，转到 50ml离心管中离心

8、，1000rpm 10min弃上清，底部为白色沉淀，加新鲜冻存液（ DMEM 60 FBS30 DMSO 10双抗1）,分装在2ml冻存管中加1ml （约每5ml细胞液原液对 应1管一1ml）,在管子上面注明日期、名称，先在4度中静置数小时，再在 液氮液面上悬3060min,之后放入液氮中冻存；7、复苏，拉线取出冻存管，用漂悬浮在盛有37度水的烧杯，烧杯置于水浴锅中， 待融化后转移到含有新鲜培养基的细胞培养瓶中混匀，进行培养，在次日一定要更新培养基，去除DMSO,以有利于后续的培养；8、细胞融合时，将3瓶生长良好的细胞液转移在 50ml离心管中，1000rpm 10min, 弃上清；加30ml

9、 DMEM离心洗涤一次，加10ml重悬混匀，血细胞计数板 计数备用；在实际培养中，大概三天后细胞基本可以长满，四天开始出现细胞死亡情况, 五天后有半数细胞死亡，六天后大部分死亡。HAT培养液浓度选择商品化HAT多为50X,先用不完全培养基溶解后（10ml一管），按比例加到完 全培养基中制成HAT培养基；HAT一股含量偏高，做梯度培养瘤细胞实验选择 合适的HAT培养液浓度；用24孔板和SP2/0进行在各孔中加等体积的培养液，培养细胞，待长成单层细胞后依照下表添加不同量 的HAT培养观察死亡情况；21.51.00.750.50.2521.5M.00.750.50.2521.51.00.750.50

10、.2521.511.00.750.50.25选择第一天死亡半数细胞；第二天死亡大部分细胞；第三天全部死亡的浓度；在实际实验中，不同梯度的 HAT均可导致瘤细胞的快速死亡，具体实验可选用 2%,亦可选用1%;饲养细胞制备在细胞融合前，三天内购买 Balb/c或KM小鼠2-3只（个体易较大），在细胞融 合当天制备饲养细胞；器材与试剂：解剖工具、5ml玻璃注射器、96孔板、50ml离心管、血细胞计数板、HAT培养液、75%的酒精、250ml烧杯；操作方法：1、将小鼠摘眼球或拉颈脱臼处死，浸泡在75%酉精中5min,随即放入超净台内， 小鼠腹部朝上；2、酒精棉球腹部擦拭消毒，用止血钳将腹部皮肤拉开，完

11、全露出腹膜；3、银子小心提起小鼠腹部皮肤，注射 5ml DMEMP，轻轻按摩腹部1-2分钟； 4、用注射器吸出腹腔内液体，转于50ml离心管中，1000rpm, 10min,弃上清液； 5、用5ml HAT®养液重悬沉淀，细胞计数，补加液体至细胞浓度为2*105个/ml ;6、加在96孔板中，每孔100微升，进行培养；（96孔板约为6块）一般18-24h后细胞生长良好；在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲 养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞 是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞 （较为常用）、小鼠脾 脏细胞或小鼠胸腺细胞。初始饲养细胞均

12、为小圆形，之后逐渐曾梭形，即巨 噬细胞，可吞噬死亡细胞残片，梭形细胞较多时，周围会出现相对空白的区 域，反之，巨噬细胞较少，在换液时应适当补充饲养细胞；脾细胞悬液制备免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中 B淋巴母细胞素浆母细胞。一般取最后 一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时 B淋巴母细胞比例 较大，融合的成功率较高。1、解剖三天（ 72-96小时）前尾部静脉注射（难以操作可腹腔注射），每只50 微克抗原加强免疫；2、解剖工具灭菌，单个牛皮纸包裹，在金属盒内灭菌；在小烧杯口裹上尼龙网， 用绳子扎紧，牛皮纸包好灭菌；玻璃注射器牛皮纸包裹灭菌；3、摘眼球处死小鼠，采血分离血清待测；小

13、鼠在 75%酒精中浸泡5min,转到超 净台内；4、解剖小鼠小心取出脾脏，剪刀碰到小鼠体外或使用次数较多则更换剪刀，以 减少污染，取出脾脏后转移到盛有 5-10ml的不完全培养基平皿中清洗，一 般更换两个平皿，然后将脾脏转移到固定在灭菌烧杯（50ml即可）的尼龙 网上，用弯头眼科剪尽量剪碎，用 5ml玻璃注射器内芯研磨脾脏；5、用不完全培养基缓慢冲洗，直到将脾脏细胞完全冲下；6、将烧杯内液体转移到50ml离心管内，1000rpm 10min,弃上清；7、不完全培养基离心洗涤一次（也可以不做）；8、用不完全培养基重悬沉淀（重悬要轻柔），获得脾细胞悬液；细胞计数，一般一只小鼠可得1.0-2.5X

14、108个脾细胞；细胞融合1）取对数生长的骨髓瘤细胞 SP2/0, 1000rpm离心10分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。2）同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤 2次。3）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1 ： 10的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用 不完全培养液洗1次，800rpm,10分钟。4）弃上清，用滴管（移液枪）吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。5）轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动（可将离心管在手臂上轻磕）。6）在37c下融合，用盛满水白大烧杯，预热到 37C,在60秒内延管壁缓慢加入预热的1ml45%PEG（Merek分

15、子量1500）含5%DMSO,边加边转动离心管；静置作用60秒钟，若冬天室温较低时可延长至 90钟；加预热的不完全培养液， 终止PEG作用，每隔1分钟分别加入1ml, 2ml, 3ml, 4ml, 5ml。7）离心，800rpm, 6分钟。8）弃上清，用已经配制好的HAT培养液取少量轻轻混悬融合细胞，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开，再混入培养液中；9）根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液。10）将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的 96孔板，200仙/孔，37C、5%CO2 在中间适当时间，制备饲养细胞，离心、重悬，并混入到HAT培养液中，与融合细胞一起铺到96孔板中；选择性

16、培养（筛选杂交瘤）一般选择HAT选择培养液维持培养三天，进行换液，每孔取 100微升加100微 开（这时可以考虑适当补充饲养细胞），观察见梭形细胞较多或原细胞被吞噬较 多较好；在培养三天，孔内相对空白较好，进行再次换液或直接进行效价检测， 发现有阳性孔，则及时进行克隆化。检测一般取样100微升，选择效价在2.0以上者，在观察对应孔细胞是否存活，存活则可克隆化，不存活可考虑放弃或在 24孔板内加饲养细胞培养一段时间，这时改用HT培养液；抗体的检测筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免 疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特 异性抗体，

17、筛选出所需要的杂交瘤细胞系。常用的方法有：ELISA、RIA、FACS（荧光激活细胞分类仪）、IFA;杂交瘤的克隆化有限稀释法的程序1）制备饲养细胞悬液（同融合前准备）2）阳性孔细胞的计数，并调细胞数在 15Xl03/ml3）取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ ml, 100 屋/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲 养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml, 100仙l/孔加D、E、F三排，为每孔 1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数 5 个/ml, 100仙l/孔，加G、H两排，为每

18、孔0.5个细胞。4）培养45天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200仙l/孔。5）第89天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。直接稀释法：1、制备饲养细胞悬液；2、阳性孔细胞计数，用不完全培养液进行倍比稀释，可选用 1.5ml离心管，每 组1ml,将细胞浓度控制在100-1000/ml,吸取含100个细胞的培养液加在20毫 开混有饲养细胞的HA培养液中，均匀铺在一块96孔板中，理论值每孔含有一 个细胞；3、培养一周左右，进行效价测定；4、每板选择一孔效价较高的进行二次克隆化，这次可不加HT和饲养细胞；培养一周左右，再次

19、进行效价测定；5、如此，直到所有测定孔均为阳性，选择测定孔最好是单细胞群落，这最可能 是单个细胞长成的群落，即单抗菌株；6、重复测定全部显示阳性，则进行扩大培养，用细胞培养瓶培养，生长稳定后 可进行细胞冻存，保留该杂交瘤细胞株；待用；进行后续攻瘤实验；瘤细胞的冻存杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安甑 含1X106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在 24 孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安甑。冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0C,再降温时一般按每分钟降温23C,待降至-70C可放入液氮中。或细胞管降至 0c后 放-70C超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存 细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性， 在液氮中细胞可保存数 年或更长时间。单抗制备简要流程：免疫动物四次间隔两周达到一定效价加强免疫三天后细胞融合96孔板 三天后换液 HAT培养（可适当添加饲养细胞）三天后换液 三天后直到孔底细胞生长良好测定效价选择阳性孔克隆化 HT培养 24孔板（阳性孔取100微升加到0.5ml中混匀，