11.环境微生物检测(精)

1、第章环境微生物检测11.111.1 空气中微生物的检测与控制11.1.111.1.1 空气中微生物的检测方法(1)(1)撞击法撞击法是采用撞击式空气微生物采 样器，通过抽气动力作用，使空气通过狭 缝或小孔而产生高速气流，使悬浮在空气 中的带菌轮子撞击到转动的营养琼脂培养 基平皿上。经 3737C C、48h48h 培养，计算出每 立方米空气中所含的细菌菌落数。后计生长的细菌菌落数。 (2)(2)自然沉降法自然沉降法是靠重力的作用将空气中 携带微生物的悬浮颗粒沉陷到直径 9cm9cm 的 营养琼脂培养基平皿上，经 3737C,C, 48h48h 培养III由于沉降法是被动采样，会造成很大的误差。

2、通过前苏联奥梅梁斯基公式换算出。通常设置 5 5 个釆样点，即室内墙角对角 线交点为 1 1 个采样点，该交点与四墙角连续 的中点为另外 4 4 个采样点。釆样高度为 1 1 2 21 1 5m5m。釆样点心远离墙壁 1m1m 以上，并避开空调、门窗等空气流通处。检测点 数越多越准确，以 20203030 个测点数为宜， 最少测点数为c=1000由于沉降法是被动采样，会造成很大的误差。5 56 6。(3)(3)过滤法过滤法是在负压下抽滤空气，使空气 通过经灭菌的微孔滤膜，空气中细菌被截 留在膜上，然后将膜转移到培养基上，使 滤膜与培养基完全贴紧，倒置于 3737C C恒温 箱培养 24h24h

3、。通过计平板上的菌落数，测定 空气中细菌的数量。空气中微生物总数目前用 CFUCFU / / m3,m3, 计量。即每立方米空气落下的细菌数， 一 般以室内空气中细菌总数 500-1000500-1000 CFUCFU / / m3m3 以作为空气污染指标。11.1.2空气微生物污染的控制控制空气微生物污染，必须减少空气中微生物的来源，特别是微生物污染严重 的医院，肉类加工等行业废水废物的处理 消毒工作； 搞好室内外环境卫生。减少微 生物滋生；绿化造林也是净化市气、除尘、杀菌和吸收有害气体的重要途径；另外空气消毒和空气净化器对净化空气也起一定 的作用。日木建议的评价空气清洁程度的标淮见表* 1

4、1-1以细苗总釵评价空气的卫生标准，（个/mJ清沽程度细葡总数清洁辱度细fWXltt 1清沽稅度细曲总数最清询的夸4V停空饲）1-2秤通空代31 125轻300清活空气30临界环境30111.2水的微生物检测及控制11.2J水质的细菌学检测生活饮用水卫生标准GB5749-85GB5749-85 关于饮用细菌总如00个加M2 大肠菌群密3个/L一、伤病症：伤寒或副伤寒。表现：持续发烧，牵涉到淋巴组织， 脾脏肿大,躯干上出现红斑， 胃肠壁溃泻。伤寒沙门氏菌二.痢疾杆菌三、霍乱弧菌型的病例中，除腹泻 外，症状还包括呕吐、蠶聽病例中在较严重或较典痢疾杆菌可引起 细菌性痢疾（与阿 米巴痢疾不同）， 症状

5、为急性腹泻, 通常大便中有血 及粘液，某些病 例中有发烧。病症:“米汤样”大便.腹 疼和昏迷等。病程短, 严重的常常在症状出 现后 12h12h 内死亡。电镜照片使用的是结晶紫 单染色，若革兰氏染色则 为阴性红色四、寄生虫真菌一般通过接触传染，不通过水传播，引起疾病的原生动物和小型后生动物也由水传播，通常 称为寄生虫。在目前发现的几千种原生动物中只有能引起人类疾病传播方式：除了饮水不卫生外，更多的是通过食物以及 昆虫血液传播如疟疾是蚊子传播，食用生肉感染肉类寄生虫等大肠菌群是人肠道中正常的寄生菌， 是一群需氧和兼性厌氧的，能在 3737C,C, 24h24h 内使乳糖发酵产酸产气的革兰阴性无芽

6、抱 杆菌，又称总大肠菌群。大肠菌群作为水体被粪便污染的指标， 也是饮水、食品等的细菌学常规检验指标 之一，通常用“大肠菌群指数”和“大肠 菌群值”表示。11-2.2大肠菌群这些寄生菌通常与人体构成互利共生关系， 当人体免疫力下降时，他们则有可能成为引起肠 炎的致病菌，他们中的个别变种还会变为极具毒 性的病菌。如大肠埃希氏菌可引起幼儿腹泻，引起美国 和日本传染病流行的 61576157 也是大肠埃希氏菌的 变种菌株。中国水质标准中规定的大肠菌群数（个/ L L）W3W3W W 100100W W 500500W W 1000010000W W 5000050000饮用水 游泳池水 地表水第一级第

7、二级第三级11.2.2.1大肠菌群检测的目的和原理（一）生理习性与肠道病原菌类似时间基本一致 （代表性）（二）在粪便中的数量较多；（比病原菌多，不会漏 检）（三股验技术较简单；（操作方便）常用的大肠菌群的检测方法有多管发酵法与膜滤法。多管发酵法（即量大可能数法 MPNMPN ）发酵法是大肠菌群测定的国家标准方法。分为二步O11-2.2.2大肠菌群的检测方法 A.A.初发酵目的：水中大肠菌群存在与否的初步判断各100ml各lOinl方法为将水样置于糖类液 体培养基中，在一定温度 下.经一定时间培养后. 观察有无酸和气体产生. 即有无发酵.而初步确定 有无大肠菌群存在。如采 用含有葡萄糖或甘露醇的

8、 培养基，则包括副大肠杆 菌；如不考虑副大肠杆菌, 则用乳糖培养基由于水 中除大肠菌群外.还可能 存在其它发酵糖类物质的试验中的培养基中加入了酸碱指示剂紫色的漠甲酚紫， 产酸时，同时培养基中口朝下放置了装满同样培养基的小试管，产气时小试管中会封闭一段气体， 被作为培养中是否产气的依据。24小时48小时aifi r r-748小时内产酸产气内产酸产 r不产酸产气产酸不产气0J进行下两阶段的检验阴性无人肠菌水中含有大肠苗群， 还需 根据这类细菌的其它特性细菌，所以培养后如发现 气体和酸并不一定能肯定48小时貝的：鉴定产酸产代茵的染色特征.好氣与否. 芽抱特征。根据：人肠菌群在固体培养基上可以在空气

9、生 长，革兰氏染色呈阴性和不生勞鞄的特性在此阶段.先将上一试验产酸的菌种移植于品红亚硫酸钠培养基（远藤氏培 养基） 或伊红美蓝培 养基表面 （划线接种是为了分离出单菌落，防治菌落不 纯干扰结果） ，这 一步氧气可以阻止 厌氧芽抱杆菌的生 长，而上述培养基所含染料物质也有抑制许多其它细菌生长的作用。结论：无大肠菌群远藤氏培养基 划线分离单菌落特征菌落X阴性结论:复发酵C.C.复发酵目的*IHE阴件反应X袞表计数结论：无大肠菌群膜滤法使用的滤膜是孔径为0.450.65p m的微孔滤膜；转移至伊红美兰 平板上。379培养24小时阳性反应 7nan处展转住及络柠细果料可疑的菌落再移植于糖类培养基中，平

10、板价冉 观察其是否发酵，是否产酸产气，最菌幺笄黑垫传 后肯定有无大肠菌群存在。圉潘牛-5 巴对于自来水厂出水，初步发酵试验一 般都在10个小发酵管和2个大发酵管 （或发酵瓶）内进行，复发酵试验则在 小发酵管内进行。根据肯定有大肠菌群存在的初步发酵 试验的发酵管或瓶的数目及试验所用 的水样量，即可利用数理统计原理， 査表得出结果。11.2.311.2.3 水微生物污染的控制控制水体微生物的污染首先必须从源头 做起，即控制排放废水， 尤其是医院废水 等微生物的含量，避免大量有害微生物进入 水体；其次，消除微生物兹生的环境。净化水 体，对地表水、游泳池水要进行定期检测， 必要时加入消毒剂以杀灭微生物

11、。发光细菌法是 2020 世纪 7070 年代后期提出的 一种微生物检测环境水质毒性的新方法。 发光细菌法简便、快速、灵敏、精度高， 凡有毒化合物、废水、废物的生物毒性均 可测定。发光细菌法已被中国国家环境保护总局 规定为测定水环境急性毒性的国家标准。11.3发光细菌的微毒检测11.3.111.3.1 发光细菌检测的原理细菌的发光过积是菌体内一种新陈代谢的生理过程。菌体含有荧光素、荧光酶、ATPATP 等发光要 素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系,发光细菌法就是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对细菌发光强度的抑制程度进而反映环境中毒物毒性大小

12、，用发光度表征毒物所在环境的急性毒件。图11-3 DXY 2乞牛物发光光度计测试系统1发光细2a 3456-光闸】；一龙子；“ 一光电誓，9不透尤外允,IO-电夕设备：11发尢水12敗iUft：13拟记录位目前国内外发光细菌的测定常用的有两种方法。新鲜发光细菌培养测定法即将发光菌接种于液体培养基中，在适当条件下（2020 土 0 0 5 5）C C 振荡培养到对数生长期，配制含3%NaC3%NaCI I盐度的适当浓度的菌悬液加入测试管中，再加入待测液， 使之与菌液接触，作用 5 515min15min后，读出并记录对照管和样品管发光强度。此法 操作较为简便。2冷冻干燥发光细菌制剂测定法即把培养

13、到对数生长期的发光细菌， 以冷冻干燥法制成干粉剂，使用时加入冷 的 2%NaCI2%NaCI 溶液复苏，使其恢复到原来的生 理状态和发光水平，然后用于测定。这是 国家标准方法，其优点是可实行测定的质 量控制。冻干粉可长期保藏方便使11.3.211.3.2 发光细菌法检测的操作C-用，操 作简便，节约时间。11.3.311.3.3 发光细菌法的应用1在水质监测中的应用2在工业废水、固体废物、废气的急性毒性检测中的应用3对重金属急性毒性效应的测定和评价4对化学品的毒性评价和安全性评价11.411.4 污染物致突变性检测(Ames)(Ames)试验该试验是通过测定有污染物存在时鼠伤寒沙门菌(Salm

14、onella typhimurium)的组 氨酸营养缺陷型(his(his )菌株发生回复突变的概率来判断污染物的致癌、致突变效应。 其阳性结果与致癌物吻合率高达 83%83%。列为评价化学物质安全性的首选力法。11.4.1 Ames试验的原理和方法鼠伤寒沙门菌的组氨酸营养缺陷型菌株，在 不含组氨酸的培养基上不能生长。但当受到致突 变物作用后， 大量细胞在遗传物质的特定座位发 生基因回复突变而成为野生型，能自行合成组氨 酸，此时培养物中虽不含组氨酸。组氨酸缺陷型 4 株亦能生长并形成菌落。AmesAmes 试验就是通道在培养物中加入待测物, 根据不含组氨酸的培养基上组氨酸营养缺陷型茵 株长出回

15、复突变菌落数目的多少判断待测物的致 突变性。(1)(1)试验菌株 釆用鼠伤寒沙门菌变异株 TA97,TA97, TATA 98,98,TAI00,TAI00, TAI02TAI02 四种菌种，又增加了TA1535,TA1535, TA1537,TA1537, TA1538TA1538 共七株。试剂牛肉膏蛋白陈培养基1000mL.pH7.21000mL.pH7.2 7 7 4 4S9mixS9mix大鼠肝匀浆 S9S9 与 NADPNADP、 G G 6 6 P P、 KCIKCI、 NaNa2 2HPO4HPO4、KHKH2 2POPO4 4和水配成混合液。在试验之前都要进行全面的生物学特性和

16、敏感性鉴定，符合要求才能使用。脂多糖屏障丢失判定是否是缺陷型牛肉蛋白(3)(3)菌种鉴定R R 因子判断菌体是否存在或失去了某种 抗药性质粒。紫外线损伤修复缺陷自发回变6组氨酸营养缺陷型 (4)(4)操作方法AmeAmes s 试验的典型操作方法有平板掺入 试验和斑点试验两种。11.4.2 Ames试验的应用1检测食品添加剂、化妆品等的致突变性， 由此推测其致癌性。2检测水源水和饮用水的致突变性，探索较 现行方法更加卫生安全的消毒措施。3检测城市污水和工业废水的致突变性，结 合化学分析，追踪污染源，为研究防治对 策提供依据。5回变诊断4检测土壤、污泥、工业废物堆肥、废物灰烬的致 突变性。以防止

17、维系生命的土壤受致突变物污染 后，再通过农作物危害人类。5检测气态污染物的致突变性，防止污染物经出大 气，通道呼吸对人体发生潜在危害。6研究化合物结构与致突变性的关系。为合成对环境无潜在危害的新化合物提供型论依据O7检测农药在微生物降解前后的致突变性, 了解农药在施用后代谢过程中对人类有无 隐患。8筛选抗突变物，研究开发新的抗痛药。抗诱变因素在抗癌作用上至关重要、随着遗传毒理学的发展，通过筛选已发现天然食物如蔬菜类、茶叶、中草药等都员有抗诱 变作用。11.5生物传感器11-5.111-5.1 生物传感器的定义与分类传感器是能感受特定的被测量的物质并按照一定规律将其转换成可用信号的器 件或装置。

18、生物传感器是用固定化生物成分或生 物体作为敏感元件的传感器。生物传感器的分类主要有三种方式。1根据生物传感器中分子识别元件即敏感元 件可分为五类：酶传感器、微生物传感器、 细胞传感器、组织传感器和免疫传感器。2根据生物传感器的换能器即信号转换器分 类有：生物电极传感器、半导体生物传感 器、光生物传感器、热生物传感器、压电 晶体生物传感器等。3以被测目标与分子识别元件的相互作用方式进行分类有：生物亲和型生物传感器和代谢型或催化型生物传感器 O O三种分类方法之间互相交义，相互渗 透。11.5.211.5.2 生物传感器基本结构和工作原理生物传感器通常由敏感元件（生物分子）、转换元件及相应的机械结构和电子线路所 组成，它以生物分子所发生的物理或化学 变化转化为相应的电信号予以放大输出, 从而得到检测结果。力子识别!測定对象敏感元件图U-7土物传感器示意生物传感器的工作原理主要有以下几 种：(1)(1)将化学变化转变成电信号(2)(2)将热变化转换成电信号(3)(3)将光信号转变为电信号(4)(4)直接产生电信号方式其他物质信号变换物理变化化学变化换能器电信号11.5.311.5.3 生物传感器在环境检测中的应用 (1)BOD(1)BOD 生物传感器应用 BOD