植物组织培养的原理、技术及其应用

1、植物组织培养的原理、技术及其应用植物组织培养(plant tissue culture)是指在无菌条件下，将外植体(植物器官、组织、花药、花粉、体细胞甚至原生质体)接种到人工配制的培养基上培育成植株的技术。由于外植体只是植物体的一小部分，因而可以研究其在不受植物体其他部分干扰的条件下的生长和 分化规律；另一方面，人们可以通过改变外植体的培养条件(如培养基的配方、光照和培养温度等)去人为地影响它们的生长和分化，这对研究器官、组织和细胞的生长、分化、发育 规律以及解决植物形态建成中的一些理论问题都很有帮助。另外，植物组织培养技术在农学、园艺、林业、医药等生产实践上也得到了广泛应用。9.3.1 植物

2、组织培养的原理前已述，植物细胞具有全能性。植物组织培养技术正是利用植物细胞全能性以及细胞极 性和再生特性，将其从植物体中分离出来并给予一定的培养条件，使这些已分化的细胞脱分化，然后在一定的条件下再分化，最后形成完整的植株。因此，组织培养中有细胞的脱分化和再分化过程。所谓脱分化(dediffere ntiatio n)，是指已经分化的植物器官、组织或细胞在离体培养时，又恢复细胞分裂的能力，并形成与原有状态不同细胞的过程。新形成的细胞群被称为愈伤组织(callus)，即具有分生能力的细胞群。再分化(rediffere ntiatio n)是指脱分化形成的愈伤组织细胞在适宜的培养条件下，又分化为胚状

3、体(embryoid)，或直接分化出根和芽等器官形成完整植株的过程。所谓胚状体是指由体细胞衍生而来的类似于胚胎结构 的细胞或细胞群。胚状体具有根、茎两个极性结构，因此可以一次性形成完整的植株(图9-6)。图9-6植物组织培养的过程932植物组织培养的技术条件植物组织培养的技术条件主要包括培养基的配制、无菌条件和培养条件等。9.3.2.1 培养基的配制植物组织培养中一个关键的步骤是培养基的配制。 不同的外植体、 不同的培养方法、 不 同的培养目的等， 都要求采用不同的培养基。 目前， 在植物组织培养上常用的培养基有十几 种，这些培养基的配方虽有所不同，但其主要成分是相同的。首先，培养基中含有大量

4、的水分，可以满足外植体生长对水分的需要。 其次，培养基中的矿质元素包括植物必需的大量矿质元素N、P、K、Ca、Mg、S 和微量元素Fe、Mn B、Cu Zn、Mo Cl以及非必需的 Na等。碳源一般采用蔗糖（质量浓度30 50g L-1）,有些培养基也采用葡萄糖。糖除了给外植体提供碳源外，还可调节培养基的渗透势。植物生长调节物质的种类， 则要根据培养的目的适当选用。 生长素类可采用 IAA、 IBA、 2，4-D和NAA等，细胞分裂素类常使用KT 6-BA、ZT等。在诱导根和芽的分化时，还需根据要求调整培养基中 CTK/IAA 的比值。维生素中，B（硫胺素）是必需的，而烟酸、R（吡哆醇）和肌醇

5、（环己六醇）虽不是必需的， 但对生长有促进作用，所以一般也添加到培养基中。有些培养基中还包括氨基酸 （如甘氨酸 ） 、水解酪蛋白、酵母汁、椰子乳等有机附加物， 以促进细胞的分化。根据培养基的物理状态，可将植物组织培养分为固体培养和液体培养。所谓固体培养， 是在培养基中加入固化剂， 使培养基呈固体状态。 所采用的固化剂多为琼脂， 最适浓度一般 为 0.6% 1%（重量 / 体积 ） 。液体培养是在培养基中不加入固化剂，培养基为液体状态。为了 保证液体培养时的氧气供应，可在液体培养基上架设纸桥或进行振荡培养。生长在自然界的植物体对土壤的pH值有一定的要求，外植体培养时也不例外。因此，最后还要将培养

6、基的 pH值调节到适当的水平。对组织培养的外植体生长而言， 培养基的组成成分是一个决定性的因素， 不同的植物材 料要求不同的培养基， 适于诱导愈伤组织的培养基不一定适于器官分化， 适于固体培养的培 养基不一定适于液体培养， 因此要想获得成功， 必须精心选择适宜的培养基。 一般常用的培 养基有下列几种：MS培养基（Murashige 和Skoog, 1962）、米勒培养剂（Mil1er , 1963） , H培养基（Bourgin 和Nitsch , 1967）、改良怀特培养基 （White , 1963）、N6培养剂（朱至清等， 1974） 。9.3.2.2 无菌条件由于培养基的营养十分丰富，

7、 微生物极易滋生而造成污染， 因此， 在植物组织培养的整 个过程中都必须保持严格的无菌条件。外植体 （explant） 的消毒通常采用氯化汞、过氧化氢、次氯酸钙、次氯酸钠或70%的酒精等，消毒后需用无菌水充分冲洗。培养基及接种用的用具必须进行高温高压 （在消毒锅中 ）灭菌。接种时须在超净工作台上 进行，操作人员的手也必须经常用 70%的酒精擦拭、消毒。培养室要尽量保持无菌状态，定期用紫外灯照射和用杀菌剂熏蒸杀菌。9.3.2.3 培养条件生长在自然界中的植物体所需的光、 温、水、气等条件， 也是植物组织培养时所需要的。 水分和氧气条件一般容易得到满足，所以植物组织培养时的培养条件主要是指光照和温

8、度， 都可通过电脑进行自动控制。由于植物组织培养大多数是在室内进行， 所以要进行人工光照， 并控制好光强和光周期。 人工光照一般采用日光灯。 也有些培养室利用自然光照， 其顶部采用可以透光的玻璃。 温度 一般控制在2528C下，有的还要求有昼夜温差 (一般昼温25C左右，夜温15 C左右)。 9.3.3 植物组织培养在生产实践上的应用1. 植物体的无性快速繁殖及脱毒 用组织培养技术进行植物的无性快速繁殖，已广泛应用于一些花卉、果树等园艺作物、农作物以及林木的育苗。 如广东、 广西和海南岛香蕉的种植已大多采用试管苗， 甘蔗和兰花 试管苗也已大量应用于生产，柑橘、 菠萝、 草莓、桉树以及其他许多花

9、卉等也利用试管苗进 行栽培。受病毒感染的马铃薯植株，除了茎尖生长锥外，其他部位往往都带有病毒。因此， 继续用块茎作繁殖材料， 必将导致后代植株染病。 若利用茎尖生长锥作外植体进行无性快速繁殖， 所生产出的幼苗将不带病毒，从而达到脱毒的目的，可解决马铃薯品种的退化问题。利用组织培养技术进行无性快速繁殖具有许多优点， 如取材少， 培养材料经济； 可人为 控制培养条件，不受自然条件的影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，便于自动化控制 等。2. 花粉培养和单倍体育种利用花粉进行组织培养可以获得单倍体植株。 进行单倍体育种， 可以加速育种的进程并 可获得纯系。我国已培育出 10 多种花粉植株，如水稻、

10、小麦、大黑麦、小黑麦、玉米、甜 菜、茄子、烟草、辣椒、杨树和橡胶树等，其中小麦“花培一号”、烟草“单育一号”等优 良品种已广泛应用于生产。3. 人工种子将植物组织培养中产生的体细胞胚包裹在含有养分的胶囊内，可像种子一样直接播种到大田用于生产，即所谓的人工种子 (artificial seed) 。天然种子中的胚是合子胚，而人工 种子中的胚是体胚 (somatic embryo) ，胚乳和种皮也是人工的。目前，已有胡萝卜、芹菜、 苜蓿、棉花、玉米、水稻、橡胶树等几十种植物的人工种子试种成功，但成本相对较高。目 前，美国的 Weyerhaeuser Company 己大规模生产 Dogras-fir ( 多格拉冷杉 ) 等树木的人工 种子。4. 药用植物的工厂化生产药用植物的有效成分多是一些次生代谢产物，它们在某些器官或组织的细胞中含量较 多。利用组织培养技术可大量繁殖药用植物的细胞或愈伤组织， 然后再从这些细胞或愈伤组 织中提取有用成分， 从而达到工厂化生产的目的。 如从人参培养细胞中提取人参皂甙， 从三