杆菌肽锌相关的开题报告

1、 毕业设计(论文)开题报告学 生 姓 名：学 号：专 业：设计(论文)题目：产杆菌肽锌微生物的育种指 导 教 师:2016年2月29日 毕 业 设 计（论 文）开 题 报 告1结合毕业设计（论文）课题情况，根据所查阅的文献资料，每人撰写2000字左右的文献综述文 献 综 述1 引言  杆菌肽是 1943年由美国哥伦比亚大学的Johnson 在从患者Tracy创伤中分离出的枯草杆菌（bacillus sabtilis）中发现的1。在随后的研究中，人们发现了杆菌肽许多优良的特性，使它在兽药、动物饲料添加剂和人医临床等方面得到了广泛的应用。杆菌肽是类白色至淡黄色的粉末，无嗅、味苦，有吸湿性

2、，易被氧化剂破坏，在溶液中能被多种重金属盐类沉淀。杆菌肽在水中易溶，在乙醇中溶解，在丙酮、三氯甲烷或乙醚中不溶。杆菌肽本身可抑制、杀灭某些致病菌,当它与Zn²+络合时,其抗菌活性会得到一定程度的增强,从而对革兰氏阳性病原菌,如葡萄球菌、溶血性链球菌、微型球菌、藤黄八叠球菌、非溶血性链球菌、魏氏梭菌、放线菌以及部分革兰氏阴性菌均产生较强的抑制作用,抗菌谱与青霉素类似2。杆菌肽的作用机理是由于它是类脂质焦磷酸的特异性抑制剂,能抑制细胞壁所合成的脱磷化过程,影响磷脂载体的转运及向细胞壁支架输送粘肤,从而抑制细胞壁的合成另一方面是与敏感菌的细胞膜结合,损伤细胞膜,使细胞膜的通透性增加导致内粘

3、质外流其次是干扰敏感菌细胞内原浆蛋白的合成3。2 杆菌肽的研究进展 杆菌肽是目前国内外广泛用于饲料中的一种新型的理想广谱抗菌素，它能够有效抑制 G+ 和 G- 细菌,如金黄色葡萄球菌、链球菌等，具有抗菌谱广、排泄快、畜禽吸收量少、安全性评估良好、不产生耐药性等很多优良特性，是饲料添加剂中传统抗生素的有效替代品，已被应用于生物表面活性剂、饲料添加剂、食品防腐剂和作为生物学的研究工具4。目前杆菌肽的工业生产主要通过微生物发酵法制得,地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是目前广泛应用的工业生产菌种。杆菌肽的发酵生产过程国外报道较多，国内相关报道不多，且发酵水平不高。我国的杆菌

4、肽发酵生产始于 20 世纪 60 年代，1967 年华北制药厂首先在国内生产杆菌肽。随着我国畜牧养殖业的兴起，杆菌肽于上个世纪90 年代开始大量生产，以芽孢杆菌为菌种，玉米和豆粕为主要原料，通过生物发酵、锌络合制备而成5。我国天津新星兽药厂选育获得的高产菌株,生产能力为 700g/ m L, 与国外报道 1200g/ m L 的水平相差还是很多。国内杆菌肽发酵工业的生产水平亟待提高.过去，由于在人畜共用抗生素的使用方面管理不严格，造成了交叉耐药菌的发生率快速上升。因此，近年来国际上加强了这方面管理，出台了“人畜共用抗生素在使用上必须相分离”的指导原则，使得杆菌肽成为当今世界销售量最多的饲料添加

5、专用抗生素之一6。随着我国经济的迅速发展和科学技术的不断提高，养殖业的发展脚步也逐渐加快，杆菌肽产品作为多肽类抗生素的一种，对于提高饲料利用率、促进动物生长起着重要作用，在动物养殖中得到广泛应用。因此，要认识到杆菌肽产品的重要作用，充分了解其特性，并且把握其发展前景，合理利用杆菌肽锌和亚甲基水杨酸杆菌肽，促进养殖业的进一步发展。3 杆菌肽测定的方法 杆菌肽（锌）的检测在实际应用中，Mariko Matsumoto 等曾用 ELISA 法测定鸡血中杆菌肽的残留量，即用辣根过氧化物酶为酶标记物，用杆菌肽抗体 Ig G 测试条进行检测。 该法简便快速，检测底限为 1 ng/m L，回收率范围为 97

6、 %103 %。 Williams 等通过 ELISA 技术分析了动物饲料中杆菌肽（锌）各组分与抗体的反应情况，以此来监测杆菌肽（锌）在贮藏过程中的稳定性。 Wan 等建立了一种 HPLC-MS/MS 法测定牛奶和动物组织中的杆菌肽 A、黏菌素 A和黏菌素 B 的方法。该方法准确、灵敏，适用于食品中多肽类抗生素的快速筛选和定量检测。 目前，我国官方颁布的检测方法有进出口商品检验局发布的 出口禽肉中杆菌肽残留量检验方法杯碟法（SN 0295-93）、农业部 2004 年发布的 饲料中杆菌肽（锌）的测定高效液相色谱法（NY/T 726-200）和国家质检总局（SBTS）2006 年发布的猪肉、猪肝

7、和猪肾中杆菌肽残留量的测定液相色谱串联质谱法 （GB/T 20743-2006）。2007 年中华人民共和国农业部公告第 824 号，确认了国家兽药残留基准实验室药物检测范围。3.1杆菌肽效价的测定方法 测定杆菌肽效价的国际常用方法是管碟法, 特别对金黄色葡萄球菌和链球菌属具杀菌作用。 是利用抗生素在特定实验菌的琼脂培养基内的扩散作用 , 形成一定浓度的含抗生素的球型区, 抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈, 将已知效价的标准溶液和未知效价的供试品溶液在相同条件下进行培养, 比较两者的抑菌圈的大小, 利用各种不同的计算原理 , 就可以准确地测定出供试品的效价。 3.2杆菌肽含量的测定方法取

8、固体培养好的地衣芽孢杆菌，无菌操作调取菌体接入发酵培养基，37恒温摇床（转速249r/min）培养24h，所得的地衣芽孢杆菌发酵液以10000r/min转速离心，取上清液即得到杆菌肽粗提液。取1.00ml粗提液经0.22m滤膜过滤后保存，滤液用于高效液相色谱法检测杆菌肽的含量。4 杆菌肽的结构杆菌肽属次级代谢产物，初级代谢贯穿于生命活动的始终,与菌体生长水平平行进行。而次级代谢一般只在菌体对数生长后期或稳定生长期进行。因此,此类微生物的生长和次级代谢过程可以划分为两个阶段,即菌体生长阶段和代谢产物合成阶段。杆菌肽在合成阶段形成的次级代谢途径7。杆菌肽的结构是由个氨基酸组成含有曝哇环的多肽复合体

9、,它有许多异构物,分别为杆菌肽A、B1、B2、B3、D1、D2、D3和E。其中A组分分子式为C66H103N17O16S,在所有的异构体中,其活性最高,含量也最为丰富见图1-3。85 杆菌肽的发酵调控杆菌肽是由地衣芽抱杆菌或枯草芽抱杆菌代谢产生的一类多肽类抗生素。氨基酸在其生物合成过程中有及其重要的作用。它们是Ba合成的直接前体,也可能作为Ba合成酶的诱导物,有报道认为,在杆菌肽生物合成中亮氨酸起诱导物作用。此外在研究中发现,Lys、Asn对地衣芽抱杆菌有特殊的刺激生长的作用,可视为生长因子,而Phe、Asp、Leu、Lle 、Cys等对生长有明显的促进作用。因此通过考察发酵液中氨基酸含量的变

10、化情况,可以分析产生菌的代谢途径,并以此为基础,研究产物与氨基酸的关系,通过人为的控制,调节代谢流向,最终提高产物产量。同时,作为一个多肽复合体,发酵时同时形成多个活性组分,寻找合适的代谢途径,选择性提高组分的产量,也是杆菌肽发酵调控的重要工作内容。85.1碳代谢物的调节作用对杆菌肽的影响在菌体生长阶段,被快速利用的葡萄糖等分解产物,阻遏了次级代谢的酶等的合成,只有当这类碳源消耗尽之后,阻遏作用被解除,菌体生长阶段转入次级代谢产物合成阶段。例如在杆菌肽发酵中加入葡萄糖,有利于菌体生长,却抑制了杆菌肽的合成,因为葡萄糖代谢生成有机酸,在酸性条件下引起的葡萄糖降解产生乙酸、丙酸在低pH下呈非解离状

11、态,容易透过细胞膜,使细胞内pH降低,从而抑制杆菌肽的合成。对杆菌肽来说,与其它多种微生物生产产物不同,我们的试验表明当加入3%柠檬酸作为碳源时可以不受干扰。因为它能很块利用,不致产生其它有机酸使pH下降而干扰杆菌肽的合成。所以,杆菌肽发酵生产中选择适合的碳源种类及用量是很重要的。95.2磷酸盐的调节作用对杆菌肽的影响通过试验研究,发现过量的磷酸盐也含有像葡萄糖一样抑制次级代谢产物的合成,生产中应引起注意,控制磷酸盐的用量,以免产物合成受到影响。实验表明,杆菌肽发酵中无机磷酸盐的浓度应控制在0.1 1mmol/L,这时可以合成杆菌肽,不受其影响。但是如果浓度高于1mmol/L,则杆菌肽合成明显

12、受到抑制。磷酸盐对次级代谢产物合成的影响是由于杆菌肽合成中的前体氨基酸,需经过ATP活化,变成氨基腺嘌呤核苷酸,同时解离出焦磷酸。而过量的磷酸盐对这步反应产生反馈抑制作用,从而抑制杆菌肽的合成。另一方面,可能改变菌体能荷状态和阻遏次级代谢产物合成中某些关键酶的合成有关。但是磷酸盐不足时,菌体生长不好,亦会影响杆菌肽的合成。96 本实验的目的在杆菌肽生产发展过程中,面临着巨大的挑战就是高产和质量问题。 杆菌肽的产量并不是单纯地扩大生产规模所能解决的问题,如何提高产品的效价，要想提高产量必须首先提高质量发酵液中的效价。 而发酵液中杆菌肽质量高低, 即含量(效价高低),涉及到多方面的因素。 本课题采

13、用获得的Bacillus licheniformi进行诱变育种，设计育种方案，优化高效筛选条件，开发高产的合成杆菌肽生产菌种。毕 业 设 计（论 文）开 题 报 告参 考 文 献1程美玲，高士争.几种新型安全抗生素类饲料添加剂J.饲料世界，2001（10）：4-6.2李德培.新型抗生素饲料添加剂杆菌肽锌J.中国饲料,1994,（12）：27-293刘凤翥.杆菌肤锌一较好的抗菌素添加剂J.中国饲料,1998,（7）：13-144于飞进,陈卫良.培养条件对 Bacilluscereus 357 生长及产生拮抗物质的影响J.浙江大学学报(农业与生命科学版),2006,163,352- 358.5吕九

14、琢,徐亚贤, 韩锡广. 杆菌肽锌生产中杂菌污染的控制J.饲料工业，2001，22（3）：29- 30. 6刘燕,王静慧.微生态学理论和我国微生态制剂的研究现状J中国兽药杂 志,2002,36(8):35- 38. 7沈萍.微生物学M.北京:高等教育出版社,2002.8林纲. 杆菌肽发酵过程中氨基酸等成分的测定方法研究和应用D. 上海医药工业研究院硕士学位沦文, 2006. 5. 9 胡尚勤. 杆菌肽高产的代谢调控J . Ca+外医药抗生素分册, 2004, 7, 15(4): 160- 162. 毕 业 设 计（论 文）开 题 报 告2本课题要研究或解决的问题和拟采用的研究手段（途径）1、 本

15、课题要研究或解决的问题： 获得高产杆菌肽锌的微生物2、 拟采用的研究手段：（1） 改变培养基中碳源含量 研究以柠檬酸（盐）代替葡萄糖作为C源，现有柠檬酸三钠和柠檬酸胺，以柠檬酸三钠为例，分别以0.5%、1.0%、1.5%、2.0%代替葡萄糖配制培养基，摇瓶培养24h后进行液相检测。 （2）改变培养基pH pH主要是影响菌体细胞膜电荷状况，引起膜渗透性的变化，以及影响营养物离子化程度，从而影响菌体对养分的吸收。由于摇瓶发酵过程中pH难以控制，因此只能控制发酵液的初始pH值。按种子发酵培养基配方将培养基的初始pH值分别调至6.5、7.0、7.5、8.0按4.0%接种量接种，于37、249r/min

16、摇瓶培养24h，用高效液相色谱法测定杆菌肽含量 （3）前体氨基酸 杆菌肽分子是由谷氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等 12 个氨基酸组成的含有噻唑环的多肽复合体，因此氨基酸的代谢在杆菌肽的生物合成中起着重要作用，如：Lys、Asn、Phe、Ile、Leu、Asp、Cys 等对生长有明显的促进作用。而谷氨酸、谷氨酰胺又是细胞氮代谢的重要中转站，发酵过程中添加的外源谷氨酸，可以促进鸟氨酸等氨基酸的合成过程、增加谷氨酰胺供量以增加细胞代谢所需氮的供给以及为杆菌肽合成提供前体。 (4)紫外诱变 通过使用超净工作台的紫外灯来达到紫外诱变的目的，通过不同时间的紫外线照射，将诱变后的菌株于37、249r/min摇瓶培养

17、24h，用高效液相色谱法测定杆菌肽含量。 (8) 金属离子对杆菌肽产量的影响将筛选后的菌, 接种到培养基中，并分别加入 0 .1 0 .4mol · L -1 磷和不同量硫酸锌 5 %、6 %、7 %、8 %、9 %、10 %、11 %、12 %、13 %、14 %的液体培养基, 37 振荡培养 42 h 后,获得含杆菌肽锌无菌发酵液.用高效液相色谱法测定杆菌肽含量。三、技术路线：地衣芽孢杆菌悬浮液液体培养稀释涂平板挑选单菌落斜面单菌落培养摇瓶培养检测杆菌肽含量筛选出高产菌株紫外诱变液相色谱分析诱变后杆菌肽含量选出高产菌株 3实验所需试剂、器材：1、 实验所需试剂：N源： 胰蛋白胨

18、酵母提取物 酵母粉 牛肉膏 多聚蛋白胨 大豆蛋白胨 鱼粉（NH4）2SO4 NaNO3 NH4ClC源： 葡萄糖 可溶性淀粉 酒石酸钠 乙酸钠 蔗糖 柠檬酸三钠 无机盐： MgSO4.7H2O Na2HPO4 KH2PO4 FeSO4.7H2O NaCl试剂： H2O2、75%酒精、 琼脂糖、P2、试验所需器材：平板、封口膜试管、试管刷、试管塞、试管架三角瓶、三角瓶刷、纱布烧杯、玻璃棒量筒容量瓶磁力搅拌器电子天平、钥匙电炉、水锅200L、1mL、5mL移液枪，1.5mL、5mL离心管，枪头，EP管摇床烘箱高压灭菌锅冰箱、超低温冰箱高速离心机水浴锅高效液相色谱仪4、进程安排和采取的主要措施第1阶段：（2015年11月）论文选题  第2阶段：（2016年1月10