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文档简介

1、细胞冻存与解冻复苏实验一、 实验目的a) 了解细胞冻存与复苏的原理。b) 掌握细胞冻存复苏的常规操作。二、 实验原理在低于-79的超低温条件下，细胞内部的生化反应极为缓慢，甚至终止。因此，采取适当的方法将生物材料温度降至超低温条件，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老死亡。当以适当的方法将冻存的生物体恢复至常温时，其内部的生化反应又可恢复正常。三、 实验仪器及试剂a) 材料：腹水瘤细胞 b) 试剂： 1、RPMI1640培养液：含10%小牛血清。2、冻存保护液1：含10%甘油RPMI1640培养液。3、冻存保护液2：含10% DMSO的RPMI1640培养液。 4、 0.4%的台盼蓝生理盐水溶

2、液。 c) 用品：普通低温冰箱、-70-80ºC超低温冰箱、 10mL低速离心机、水浴锅（37）细胞计数板、细胞冻存管、Parafilm封口膜、细胞冻存盒、1000L及10L枪、1000L枪及10L枪对应枪头、计数用盖玻片等 四、 实验步骤a) 冻存操作 1、收集细胞。2、分别用培养液和两种冻存保护液重悬细胞，转入经检查无破裂的冻存管中。3、封口。4、写标签。5、冻存。4 冰箱2030 min；-20 冰箱2030 min；-80冰箱中或液氮罐中。  b) 复苏操作1、复温。从液氮中取出冻存管，立即投入37 温水中快速晃动12min，直冻存液完全溶解。2、洗去冻存保护液。将

3、细胞冻存悬液移入带盖离心管中；加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀；1000rpm离心5min，弃上清液。3、检查细胞活率。用1ml培养液重悬细胞，台盼蓝染料排除法检查细胞存活率。五、 实验结果冻存冻存活细胞数630死细胞数1318生理盐水和培养液中没有观察到细胞。六、 实验分析a) 冻存液中细胞存活率：冻存：6/(6+13)=0.316冻存：30/(30+18)=0.625可以看出，冻存液中的细胞存活率更高，说明冻存液的冻存效果更好。b) 生理盐水与培养液对细胞不起保护作用，所以细胞都死了，而且在进行前面的离心等步骤的时候，由于它起不到保护的作用，所以使死细胞都变成了碎片，在离心时被去除了，所以

4、视野当中没有被染成蓝色的死细胞。c) 在显微镜下观察到死细胞呈蓝色，而且体积比活细胞大，而濒临死亡的细胞的体积则更大。七、 实验注意事项a) 塑料冻存管在使用前要仔细检查，以防管壁破裂或螺口不配套造成密封不严。b) 用DMSO作为冻存保护剂时，用前应先将冻存液在4预冷，解冻后应马上洗去保护剂。c) DMSO有剧毒，使用时要特别注意。此外，在冻存前越晚加入细胞越好，解冻后要尽快除去，以避免对细胞的毒害。d) 如用液氮冻存，应注意以下几点： i. 在液氮罐存取细胞样品时要注意防护，以免冻伤。放细胞时最好带布手套防护手，打开液氮罐时头应偏向一边防护脸；加液氮时要全面防护好眼、手、脚等身体暴露部位；打开液氮罐时要慢，防止液氮突然气化太多喷出。可先开一个小口，待气跑出一部分后再逐渐开大。 ii. 在液氮罐放置样品时应间隔一定距离，系

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