实验四细菌地划线分离与培养

1、实验四 细菌的划线分离与培养一、实验前要说明的几点问题点名, 查看学生出勤情况。总结上次作业，提出作业中出现的问题并讲解。二、板书部分（一）目的要求1. 掌握需氧菌分离培养的基本要领。2. 了解厌氧菌的分离培养原则及方法。（二）实验容1. 用普通琼脂平板做一次划线分离培养。2. 用普通肉汤做一管大肠杆菌的移植培养。3. 用普通琼脂斜面做一管金黄葡萄球菌的移植培养。4. 用划线法进行真菌的分离培养（示教）（三）作业1. 为什么要进行细菌的分离培养？2. 进行分离培养应注意哪些事项？3. 细菌分离培养的方法有哪些？（重点叙述平板划线法）4. 叙述真菌的划线分离方法。三、实验容主要容有分离培养及目的

2、、注意事项、分离培养的方法、真菌的培养方法、 患病动物病料中分离培养、钓菌、移植。1. 什么是分离培养及目的： 分离培养是细菌学检验的基本技术之一。 分离培 养之目的，在于从被检材料中由多种细菌里分离出一种细菌。2. 注意事项：1）分离培养前应考虑所分离的细菌的特性，选择适合其生长需要的培养基 （需氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等）等。例如：链球菌在普 通琼脂不长，要加血清或血液。 大肠杆菌和葡萄球菌要求较低， 普通的培养基即 可生长。2）防止污染。分离培养的整个过程要严格无菌操作。培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰； 操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。3）防止

3、接种器械过热，很容易杀死分离培养的细菌，如接种环在烧灼灭菌 后，不能立即钓取细菌材料， 应在酒精灯旁凉凉； 另外还应注意防止已钓取菌料 的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。4）初代分离时发现有多种细菌，观察找到目的菌落，再拿一肉汤培养基纯 化培养。然后在接种实验动物，作成凝集抗原，做血清学鉴定， 。还可以反过来 做抹片染色观察。3. 分离培养的方法： 主要分需氧菌的分离培养方法、厌氧菌的分离培养方法和需要CO菌的培养分离方法。1）需氧菌的分离培养法（1）平板划线法：划线后有单个菌落，便于观察菌落的形态、溶血性等。 方法左手拿琼脂平板，使其与水平面成 45。角；右手拿铂金耳，使之与水平面平 行，

4、靠近酒精灯火焰操作。将接种环于酒精灯火焰中灼烧灭菌，待其冷却后，蘸 取欲检材料少许，注意不要划破琼脂，不要划得太疏，以免造成浪费，不要重复 划线，以免形成菌苔。划线方法：方格划线、蛇形划线、区域划线、交叉划线， 选择其中一种进行划线。 划毕，将接种环烧灼灭菌， 于皿底用蜡笔标记被检材料 名称及日期，倒转置恒温箱中培养。 思考题：方格划线哪个地方会长出单个菌落比较多？（2）倾注法：不常用，这里不做介绍2）厌氧菌的分离培养方法厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离氧的存在。 故在培养厌氧菌时， 必须创造 一个厌氧环境， 一般以降低氧的力或保持减低的氧力为原则。 目前应用于厌氧菌 的分离方法颇多，现就其中较

5、简便且常用的几种方法介绍如下：（1）焦性没食子酸法 利用焦性没食子酸在碱性溶液能大量地吸收氧的原 理进行厌氧培养。 通常 100cm3 空间用焦性没食子酸 1g，10%氢氧化钠或氢氧化钾 10ml。具体方法有下列有平板培养法、 干燥器培养法。 平板培养法是将厌氧菌划 线接种于适宜的琼脂平板， 取一小团直径约 2cm的脱脂棉，置于平皿盖的面中央， 其上滴加 10%氢氧化钠溶液约 5ml；在靠近脱脂棉的一侧放置焦性没食子酸约0.5g, 注意暂勿使两者接触，立即将已接种好的平板覆盖于平皿盖上，迅速用融 化的石蜡密封平皿边缘周围。 封毕， 轻轻摇动平皿， 使被氢氧化钠溶液浸湿的脱 脂棉与焦性没食子酸接

6、触，然后置 37恒温箱中培养之。干燥器培养法是于干 燥器底部放入氢氧化钠溶液适量， 然后再放入 2-3 个略高于液面的玻璃圆柱 （如 链霉素小瓶），将适量焦性没食子酸用纸或纱布包好，放置于圆柱上面，使暂勿 与氢氧化钠接触， 然后放下隔板， 将已接种的培养皿或试管置于隔板上， 待一切 准备好后，将盖盖好密封， 并轻轻摇动干燥器， 使焦性没食子酸落入氢氧化钠溶 液中。（2）高层琼脂柱摇震培养分离法取长约 15cm，直径约 5mm的玻璃棒一支，一端塞以小木塞，另一端塞以棉 花塞，高压灭菌备用； 加热融化一管适合分离厌氧菌用的琼脂培养基， 待冷却至 50左右，接入少许经适当稀释的待分离的培养物或含菌材

7、料，充分摇震均匀； 在琼脂凝固前，迅速以无菌滴管吸取上述已接种的琼脂培养基，注入上述（1）准备好的玻璃管，置恒温箱中培养。（3）连二亚硫酸钠法 将已接种的平板或斜面培养基，置于一玻璃干燥器（预先测出体积） ，按每 1000ml 容积称取连二亚硫酸钠（又称保险粉）和无水碳酸钠各 4g，并分别研细 均匀，临用前混合置于一平皿， 放在培养基上层， 然后将盖盖严， 用凡士林密封， 置 37恒温箱中培养。2）二氧化碳培养法 少数细菌如布氏杆菌（牛型） ，在含有 10%二氧化碳的环境下生长良好。要创造 这样的环境， 常用的方法为烛缸法。 将接种的培养基置玻璃干燥器或其他可以密 闭的玻璃缸，于其点燃一小段蜡

8、烛，加上盖（盖边涂凡士林以防漏气） ，约一分 钟左右蜡烛熄灭，此时缸氧气已被耗尽，缸所含二氧化碳约10%。注意蜡烛勿太长， 而且不宜靠近缸壁， 以免因局部玻璃过热而破裂。 凡士林不能 太多也不能太少，多了盖子滑落，少了则封口不严。4. 真菌的分离培养法（简单介绍） 应用细菌的平板分离法（划线、倾注） ，能容易而满意地得到真菌的纯培养。 划线法： 2-5 天长霉菌。1）取琼脂培养基熔化，冷却至 45，注入无菌平皿中，每皿 15-20ml ，作 成平板待用。2）取要分离的材料（如田土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌）少许， 投入盛无菌水之试管中，摇振，使分离菌悬浮水中。3）将接种环经火焰灭菌并冷却

9、后，蘸取上述悬浮液，进行平板划线。4）划线完毕，置温箱中培养 2-5 天，待形成子实器官后，钓取单个菌落的 部分，制片检查。 若只有一种菌生长， 即得纯种。 另外，亦可在放大镜的观察下， 用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝， 直接放在平板上作分离培养， 即可获得 该种真菌的纯培养。5. 自患病动物病料中分离病原菌方法（简单介绍）1）琼脂斜面分离法 取琼脂斜面三管，用接种环蘸取欲检病料少许（如为脏器， 现将表面灼烧后，用灭菌解剖刀切开，以接种环由切面钓取组织） ，混合于第一 管的凝集水中，再做斜面划线；然后取出接种环，不经烧灼，继续在第二管、第 三管斜面上作同样的划线。划毕，置温箱中培养。经此法

10、分离培养后，第二管的 菌落较第一管为少， 第三管的菌落更少， 如此较易得到单个菌落， 达到纯培养之 目的。2）琼脂平板涂布分离法 液体被检病料如血液、腹水等，可用灭菌毛细吸管或 吸管吸取， 置 1-2 滴于平板中央， 用 L 形玻棒或玻璃刮铲作均匀涂布。 如为脏器 病料，可先做成乳剂再行涂布；或取其一小块，用镊子夹住，表面烧烙后，用灭 菌刀切开，以其切面直接进行涂布。此法适用于含菌量较少的病料的分离。3）通过试验动物分离法 被检材料中疑有某种病原菌存在，可将病料接种于有 易感性的动物体，如疑有猪丹毒杆菌存在的病料，可注射于鸽体，鸽死后，再取 其脾脏以分离猪丹毒杆菌，常可得到纯培养。四、钓菌和纯

11、培养 被检材料经分离培养后， 选择欲分离的可疑菌落， 用灭菌接种环 （针）钓取少许， 接种在新的培养基上， 称为钓菌。 钓取一个菌落培养出来的细菌培养物， 称为纯 培养。纯培养的目的在于进一步进行微生物学检验和其他试验研究。方法：首先用肉眼或放大镜观察并选择可疑的单个菌落， 然后以蜡笔在可疑菌落 下面的平皿底上作一记号， 用灭菌的接种环 （针）轻轻接触菌落， 蘸取菌料少许， 作抹片，染色，镜检。如其形态一致， 即接种于适当的培养基上， 置温箱中培养。6. 细菌和真菌的移植方法（简单介绍）1）接种环移植法 :以左手持长有细菌 （或真菌）的菌种和无菌的琼脂斜面各一管， 管口并齐，管底握于掌中，以右

12、手作握笔状紧执接种环，并进行火焰灭菌；以右 手的小指和无名指扭开并夹住第一管的棉塞， 无名指和中指扭开并夹住第二管的 棉塞，或以小指和无名指同时扭开并夹住两管的棉塞。 将管口通过火焰灭菌， 然 后用烧灼灭菌后的接种环插入菌种管， 钓取少许菌料，接种于无菌的琼脂斜面上。 同样将管口通过火焰灭菌后， 塞好棉塞， 最后将接种环烧灼灭菌， 用蜡笔在试管 上标记菌名、日期，置温箱中培养。 厌氧菌移植常用培养基和培养方法如上述钓 菌项。2）吸管或注射器移植法 : 移植定量的液体培养或表面有液体石蜡的厌氧菌培养 物，一般也可以利用吸管或注射器移植， 其操作方法系以无菌吸管或无菌注射器 吸取培养物，代替接种环

13、进行移植。四、示教1. 用普通琼脂平板做一次划线分离培养：点上酒精灯，取实验三所做好的普通 琼脂平板，倒置，将培养基靠近酒精灯呈 45 度打开，然后用铂金耳钓取一环菌 在培养基上划线，选四种（方格划线、蛇形划线、区域划线、交叉划线）画法中 的一种。2. 用普通肉汤做一管大肠杆菌的移植培养：手拿大肠杆菌的培养试管和一管肉 汤培养基，充分震荡。靠近酒精灯，灼烧管口，充分灼烧铂金耳，放到酒精灯旁 边放凉，打开试管塞，灼烧试管口，将铂金耳钓取一环菌，然后将铂金耳放到肉 汤培养基，摇晃。灼烧铂金耳，灼烧试管口，把试管塞上。充分灼烧铂金耳。将 接好试管和铂金耳放到试管架。3. 用普通琼脂斜面做一管金黄葡萄

14、球菌的移植培养： 用相同的方法接种， 在斜边 培养基 上划线。放到温箱培养。4. 用划线法进行真菌的分离培养（示教） ：与细菌的划线培养相同，画好线后放 如温箱培养（ 30）， 2-5 天，待形成子实器官后，钓取单个菌落的部分，制片 检查。若只有一种菌生长，即得纯种。另外，亦可在放大镜的观察下，用无菌镊 子夹取一段待分离的真菌菌丝， 直接放在平板上作分离培养， 即可获得该种真菌 的纯培养。五、实验中应注意的问题 1）分离培养前应考虑所分离的细菌的特性，选择适合其生长需要的培养基（需 氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等）等。例如：链球菌在普通琼 脂不长， 要加血清或血液。 大肠杆菌和葡

15、萄球菌要求较低， 普通的培养基即可生 长。2）防止污染。分离培养的整个过程要严格无菌操作。培养基和一切用具必须彻 底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。3）防止接种器械过热，很容易杀死分离培养的细菌，如接种环在烧灼灭菌后， 不能立即钓取细菌材料， 应在酒精灯旁凉凉； 另外还应注意防止已钓取菌料的接 种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。4）初代分离时发现有多种细菌，观察找到目的菌落，再拿一肉汤培养基纯化培 养。然后在接种实验动物，作成凝集抗原，做血清学鉴定， 。还可以反过来做抹 片染色观察。六、作业1. 为什么要进行细菌的分离培养？2. 进行分离培养应注意哪些事项？3.

16、 细菌分离培养的方法有哪些？（重点叙述平板划线法）4. 叙述真菌的划线分离方法。七、本次实验总结1. 掌握划线法，熟悉四种划线方法。以及细菌的移植方法。2. 在操作过程中要防止污染。 分离培养的整个过程要严格无菌操作。 培养基 和一切用具必须彻底灭菌； 操作时必须靠近火焰； 操作完毕后， 禁止再让培养基 接触外界空气。3. 操作的过程中要注意不要让接种器械过热。 防止杀死细菌或真菌， 如接种 环在烧灼灭菌后， 不能立即钓取细菌材料， 应在酒精灯旁凉凉； 另外还应注意防 止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。八、附：实验四：细菌的划线分离与培养实验所需物品一、试验材料名称组别数量合计

17、备注1、酒精灯5 210火机（柴）2、接种环5 2103、培养基自备用前融解普通琼脂4、菌种大肠杆菌肉汤、金黄色葡萄球菌斜面每组各1 管5、病料粪便6、霉菌菌种7、真菌培养基（马铃薯葡萄糖培养基，应提前制备平板每班2 个）8、9ml 生理盐水试管 4 只9、5ml 吸管10、吸球11、酒精棉球二、仪器设备名称1、干燥箱 1 台2、水浴锅 1 台3、培养箱 1 台表 1、试验仪器设备统计表学院牧医工程 实验室名称畜牧微生物 实验名称实验四细菌的划线分离与培养仪器设备名称数量 （台、套）设备 现状备注药品柜2个有1个恒温培养箱1台有烘烤箱1台已坏普通水箱1台无低温水箱（冰柜）1台无高压灭菌器1台已坏流通蒸汽灭菌器1台无水平式电动离心机1台无抽水机（真空泵）1台无赛式细菌滤器1套无G1-6 波动滤器1套无显微镜32台有超净台1台无无菌室1个无试验台7个有试验台灯7套已坏 4 套分类容试剂名称实验人数组数组试 均剂 消量 耗蒸 馏 水单价人均消耗再情 利况 用香柏油3261瓶5000ml二甲苯3261瓶牛肉膏培1瓶5000ml氯化钠养1瓶蛋白胨细1瓶琼脂粉菌1瓶碱性美兰染1瓶KOH色1瓶草酸铵制1瓶结晶紫备1瓶碘片各1瓶碘化钾种1瓶碱性复红标1瓶本片合计表 3. 实验用低值易耗品及实验动物统计表系别： 牧医 实验室名称： 畜牧微生物 实验