反相高效液相法分析罗汉果皂苷V

1、反相高效液相法分析罗汉果皂苷 V基本知识( 1)皂苷 V 的基本知识 皂苷是罗汉果中的一种非糖甜味成分，为极性较强的大 分子化合物，不易结晶，易溶于水和醇，难溶于有机溶剂， 具多种生物活性。皂苷V (又称甜苷V)易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶 剂，不溶于石油醚、氯仿等低极性有机溶剂。( 2 )反相高效液相色谱法( RP-HPLC )的分离机理 RP-HPLC 是高效液相色谱法中较常用的分离方法， 其机 理是采用流动相极性大于固定相的流动相来分离含极性官 能团的有机化合物；分子在反相色谱柱中是按其极性的大小 移动，极性越大被洗脱出越快；选题意义及国内外发展状况 近年，甜苷类化合物越来越吸引人们注意

2、，而目前我国 对罗汉果皂苷提取物的分离、纯化以及含量测定的研究依然 极少。皂苷 V 是甜苷中的主要甜味成分， 罗汉果甜苷类产品质 量一般以罗汉果皂苷 V 的含量来评价。 故对皂苷 V 提取和含 量分析具重要的意义。反相高效液相色谱法测定罗汉果中皂苷 V 的含量 实验用品。（1）材料罗汉果干果； 罗汉果甜苷 V 标准品来源： 中国药品生物 制品鉴定所；纯度（ R）： 100%（2）主要试剂乙睛（色谱纯） 、蒸馏水、甲醇（分析纯） 、乙醇（分析 级）（3）使用仪器高效液相色谱仪、电子天平、 粉碎机、 紫外 - 可见分光光 度计、多用途恒温超声提取机、电热恒温干燥箱实验步骤。（1）罗汉果的预处理将罗

3、汉果干果粉碎成粉末后，置于60 C左右干燥箱中，干燥 4h 后密闭保存，备用。（2）提取方法的确定（常规水煮法、超声法和加热回 流的比较）经过查阅超声、常规水煮及加热回流提取罗汉果中甜苷V 的相关资料，在各方法最佳条件下：常规水煮法对罗汉果 甜苷的提取率为2.43% ,而罗汉果甜苷的含量在 3.763.86% 范围内，故提取不完全；超声法（ 3 .59% ）和加热回流法（3.55%）对罗汉果甜苷的提取率差不大，而加热回流法对罗汉果甜苷的最佳提取所用的时间是超声法的4 倍，且繁琐复杂。从而确定超声法为本实验的提取方法。（3）对照品溶液的配制精密称取皂苷 V标准品10.34mg，用23%的乙睛定容

4、于 50ml 容量瓶中，配制成 0.2068mg/ml 的对照品储备液。（4）样品溶液的制备（5）波长的选择将制好的皂苷 V 对照品溶液和 ?悠啡芤河诜止夤舛燃葡 陆?行波长测定，发现 2 者在 203nm 处吸收峰均为最大，故 令检测波长为 203nm。（6）色谱体系的确立 色谱柱的选择 罗汉果中含有多种三萜皂苷类化合物，具相同苷元，结构类似， 极性极相近， 其区别仅在于所连接的葡萄糖基不同； 而-NH2为碱性，具强氢键结合能力，对某些多官能团化合 物具好分离。故选氨基柱为检测的色谱柱，通过氨基键合相 上的 -NH2 与糖类分子中的 -OH 间选择性相互作用，从而使 皂苷达到很好分离效果。故

5、采用 NH2 柱作为实验的色谱柱， 使罗汉果皂苷被有效洗脱 流动相的确定 由于高效液相色谱中所用的流动相为液体，组分在流动相中受到亲和力的作用。故对组分的分离度，流动相起很大 影响；经由查阅相关资料， 乙睛 -水溶液对罗汉果皂甙分离效 果较好：本文研究了 20%25%的乙腈水溶液对罗汉果甜苷 分离效果。发现各色谱峰能较好分离所用乙腈水溶液为 23%。低于 23%的乙腈水溶液为流动相时，洗脱能力低，主 峰与杂质峰重叠现象严重； 随着乙腈 -水溶液的浓度增加 （由 23% - 25% ）时，分析时间J,洗脱能力f,但分离时间延 长，甚至主峰不出现。综上，可确定 23%乙腈水溶液为本实验的流动相。

6、色谱的分析条件色谱柱：Shodex Asahipak NH2 柱（4.6mmlD x 250mm 5um）;流动相：乙腈水溶液（乙腈：水 =23 : 77）,用氨水调 pH=7.0;流速v=1.2mL/min取波长入=203nm进行检测；进 样量：10.000卩L;定量方法：外标法；检测灵敏度：0.08;柱温：22.5 C；柱压：1.0MPa;湿度：59%。（ 7）罗汉果甜苷 V 色谱峰的判定 本实验利用甜苷中分子极性差异来分离出罗汉果甜苷 V，极性大的先出，极性小的后流出。对应标准品色谱图， 由保留时间来判断出样品的色谱峰。 甜苷提取物在 RP-HPLC 柱中进行分离时, 罗汉果苷均在皂苷

7、V 前出。 故罗汉果各苷 对皂苷 V 的分离纯化无大的影响。（ 8）系统适用性试验按 2.2.6条件下,精密吸取 10.000?L 的皂苷 V 对照品溶 液和样品溶液各一份，进行高效液相色谱仪的测定。结果： 皂苷 V 在色谱柱上的 tR=10.5min 。皂苷 V 与其相邻杂峰实 现了基线分离，分离度 R>1.5 ，对照品溶液与样品液得到了 充分的洗脱和良好的分离。 按罗汉果苷 V 峰面积的理论塔板 数 N > 5000。(9)回归方程准确吸取皂苷 V对照品溶液(0.2068mg/ml )的2?L、5?L、10?L、 30?L、 50?L 分别进样，结果为：回归方程丫=45.779

8、+0.7406 ( n=5),相关系数八2=0.9999，罗汉皂苷 V 进样量在250?L内与峰面积具很好线性关系， 即皂苷V含 量的线性范围为 0.417210.4300 ?g。(10)样品测定精密吸取皂苷 V样品溶液10.000卩L,进样，在2.2.6 条件下平行测定 3 次，皂苷 V 浓度( C/mg?ml-1 )分别为 0.16023、 0.1605、 0.1560，对应的皂苷 V 的色谱峰面积(mAU?s)分别为 355.5632、356.0322、354.7482，罗汉果 质量为0.5M/g，计算所含皂 V的含量()分别为1.6507、 1.6529、 1.6469，即皂苷 V 的

9、平均含量为 1.6502%。质量标准分析方法验证。( 1 )精密度考察精密吸取对照品溶液，连续进样5次，每次10?L,在2.2.6条件下测定，记录皂苷 V的峰面积(mAU?s)分别为458.2954、455.1334、450.0102、454.9787、456.2344，平均 值 454.9304；相对标准偏差 RSD（ %）为 0.6710%（ n=5）， 表明本实验所用的仪器具良好精密度。（2）稳定性试验取同一样品溶液，隔60min进样一次，平行5次，按226 条件测峰面积，进样时间 /min 为 0、60、120、180、240 分 别对应的峰面积 （ mAU?s ）为 358.0511

10、、354.9897、360.1955、 353.1956、357.0984；平均为 356.70606 mAU?s由结果，可知待测组分在 0240min内，色谱峰面积未 明显改变，经计算， RSD为0.7601 ;则被测物在0240min 内保持稳定。（3）重复性试验按“ 2.2.1 ”预处理，精密称取 0.5g粉末，共6份。分别 按“2.2.4”制备甜苷 V 供试品溶液， 按“2.2.6”条件进样（每 次 10?g）; HPLC 法测定并计算含苷 V 的含量，得到 RSD 0.5457%，说明本实验所用的分析罗汉果甜苷 V 的方法重复 性高。（4）考察加样回收率试验称取一定量的含量为 1.6

11、502%的罗汉果干果按“ 2.2.1” 预处理；精密称取干燥的罗汉果粉约0.45g，共6份；每份按“ 2.2.4”法制备供试品溶液后，分别精密加入4mL 的0.2068mg/ml 甜苷 V 对照品溶液，再按“ 2.2.6”项测定其含 量，所得平均回收率为 99.1301%，相对标准偏差为 0.6126% ， 故本实验回收率好，准确度高。结论( 1)从常规水煮、超声法和加热回流3 种提取法中，确定超声提取罗汉果甜苷是最有效的：以甲醇提取，料液比1: 30,功率800W，频率26.8KHZ，常温提取约 30min。该 法很大程度提高了罗汉果甜苷的提取率与提取速度。(2)用Shodex Asahipak NH2柱分离罗汉果甜苷 V，为 制备甜苷 V 对照品的提供很好途径。( 3)以 NH2 柱为色谱柱的基础上，建立了 RP-HPLC法分析罗汉果甜苷 V【色谱柱：Shodex AsahipakNH2柱(4.6mmlD x 250mm 5um);流动相：乙腈水溶液(乙腈： 水 =23: 77),用氨水调pH=7.0 ;检测波长：203nm;流速： 1.2mL/min ; ?M样量：10.000卩L;检测灵敏度：0.08;柱温： 225C ;柱压：1.0MPa ;湿度：59%。】(4) 本文所建立的 RP-HPLC 法,系统适用性好,可使