姜黄素对缺血再灌注大鼠海马神经元Bax和Bcl2表达的影响

1、姜黄素对缺血再灌注大鼠海马神经元Bax和Bcl-2表达的影响【摘要】 目的 明确姜黄素减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的作用是否通过c-jun氨基末端激酶（JNK）的非核通路。方法 将实验动物随机分为4组：假手术组（sham组）、缺血再灌注组、给药组和给药对照组。脑缺血再灌注模型采用SD大鼠四动脉结扎法, 给药组大鼠在缺血前20 min腹腔给予40 mg/kg姜黄素, 用免疫印迹法分析JNK底物bcl-2以及Bax的表达。结果 脑缺血再灌注后Bax的表达增加, 而bcl-2的表达减少。姜黄素可以抑制Bax的表达以及增加bcl-2的表达。缺血再灌注组、给药组和给药对照组Bax和bcl-2的表达分别为假手

2、术组的4.5倍、1.3倍、4.3倍和3.2倍、1.2倍、3.6倍。结论 姜黄素减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的作用可能与抑制神经元凋亡的非核通路有关。 【关键词】 姜黄素 脑缺血再灌注损伤 bcl-2 Bax 大鼠 Abstract: Objects To investigate whether the neuroprotective effect of curcumin on transient brain ischemia/reperfusion is related to the non-nuclear pathway of JNK. Methods SD rats were randomly

3、 divided into 4 groups: sham group, ischemia group, vehicle group and curcumin treatment group. Transient (15 min) brain ischemia was induced by using the four-vessel occlusion method in SD rats. Immunoblotting was used to detect the expression of bcl-2 and Bax. Curcumin 40mg/kg was administrated to

4、 the rats in treatment group 20 min before ischemia. Results It was found that cerebral ischemia enhanced the expression of Bax and inhibited the expression of bcl-2. Pretreatment of curcumin could inhibit the expression of Bax and enhance the expression of bcl-2. The Bax expression in ischemia grou

5、p, curcumin treatment group and vehicle group was 2.6, 1.4 and 2.4 folds that in the sham group respectively; the bcl-2 expression in ischemia group, curcumin treatment group and vehicle group was 0.5, 0.9 and 0.6 folds that in the sham group respectively. Conclusion The neuroprotection of curcumin

6、may be related to the non-nuclear pathway of JNK. 2 / 10 Key words: curcumin; brain ischemia/reperfusion; bcl-2；Bax 姜黄素（curcumin）是从植物姜黄中提取的色素成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血脂等广泛的药理作用，而且毒性很低。本实验室的研究结果提示姜黄素还可以减轻脑缺血再灌注造成的神经元损伤1，但其抗脑缺血再灌注损伤所涉及的信号转导机制尚不清楚。本研究采用大鼠四血管结扎脑缺血再灌注模型结合蛋白免疫印迹技术，以探讨姜黄素减轻缺血性神经元损伤的作用是否与抑制c-jun氨基末

7、端激酶（JNK）介导的非核通路有关。 1 材料和方法 1.1 实验动物及药品 雄性SD大鼠，体质量（275±27）g，由徐州医学院实验动物中心提供。姜黄素、Bax抗体、bcl-2抗体购自Sigma公司。 1.2 脑缺血再灌注模型制备2 以20%水合氯醛（300 350 mg/ kg）腹腔注射麻醉大鼠后，分离双侧颈总动脉并电凝椎动脉。手术第2天动物于清醒状态下结扎双侧颈总动脉，使全脑缺血15 min，然后进行再灌注。缺血时保持其直肠温度在36. 5 37. 5。以缺血动物体征的出现（翻正反射消失、四肢僵直、眼球苍白、瞳孔散大）来判断缺血模型的可靠性。假手术组（sham组）处理同前，但不

8、结扎双侧颈总动脉。 1.3 动物分组及处理 实验动物随机分为4组：sham组、缺血再灌注组、给药组和给药对照组。给药组于脑缺血前20 min腹腔注射40 mg/ kg姜黄素，给药对照组给予相同体积的生理盐水。 1.4 样品制备和蛋白测定 大鼠缺血15 min再灌注6 h后，断头后快速取脑，分离双侧海马，置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行：从液氮中取出海马加1.5 ml匀浆缓冲液，匀浆前加入蛋白抑制剂；用Teflon匀浆器高速匀浆（10 s×6次），1000 g 离心20 min ，小心移取上清液（主要为海马的胞质部分）；以牛血清白蛋白为标准蛋白测样品蛋白后分装，置- 80冰箱

9、待用。 1.5 免疫印迹法检测 将等量蛋白样品（每个泳道100 g） 经10% SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，以湿转法电转移至硝酸纤维素膜（NC膜）上。转移后的NC膜经3%BSA封闭后加入稀释好的Bax、bcl-2一抗（1200），4过夜。用洗涤液洗膜，加入相应二抗（110000），37反应2 h。洗膜，以NBT/ BCIP 显色，反应达到要求后，流水洗涤终止反应。所得NC膜直接用图像处理仪（Gene Company）处理。 1.6 统计学处理 数据以±s表示，统计学分析采用方差分析（ANOVA），多个实验组与1个对照组比较用最小显著差法（LSD），实验组之

10、间比较采用q检验（Newman - Keuls test）。检验水准：=0. 05。 2 结 果 2.1 姜黄素对脑缺血再灌注后海马脑区bcl-2表达的影响 免疫印迹结果显示：缺血再灌注组的bcl-2的表达显著减少，约为假手术组的0.5倍；而与缺血再灌注组相比，缺血前腹腔注射姜黄素组的bcl-2的表达显著增加，为假手术组的0.9倍，溶剂对照组bcl-2的表达程度与缺血再灌注组相当，为假手术组的0.6倍，经分析具有统计学意义（图1，P<0.05，n=8）。 2.2 姜黄素对脑缺血再灌注后海马脑区Bax表达的影响 免疫印迹结果显示：缺血再灌注组的Bax表达量显著增加，约为假手术组的2

11、.6倍；而缺血前腹腔注射40 mg/ kg姜黄素能显著抑制Bax表达的增加，为假手术组的1.4倍；溶剂对照组Bax表达量与缺血再灌注组相当，为假手术组的2.4倍，经统计学分析具有显著性差异（图2，P<0. 05，n=8）。 3 讨 论 目前对丝裂素活化蛋白激酶家族（mitogen activated protein kinase，MAPK）成员之一的c-jun氨基末端激酶（c-jun N2 terminal kinase, JNK）通路的研究提示其在脑缺血性神经元凋亡中发挥重要作用 3,4，其中JNK激活是细胞凋亡的必要条件。激活的JNK引起 Bcl-2或其他抗凋亡Bcl-2家族

12、成员下调，或促凋亡Bcl-2家族成员如Bax在线粒体膜上过度表达和移位，均导致线粒体通透性增加并引起线粒体损伤，线粒体随后释放细胞色素c和激活Caspase 9Caspase 3通路，引起缺血性神经元凋亡，此乃神经元凋亡的非核通路（non-nuclear pathway）5。 姜黄素是一种安全有效的具有抗癌、 抗炎、抗氧化等多种药理活性的药物6。对姜黄素的药理学研究表明其有抗细胞凋亡作用，如Hossain等7发现对姜黄素敏感的JNK可以抑制NaAsO2引起的Caspase活化，从而抑制NaAsO2引发的细胞凋亡。本实验室近期的研究结果提示姜黄素可以减轻脑缺血再灌注神经元损伤 1，其抗脑缺血再灌

13、注损伤所涉及的信号转导机制与抑制JNK介导的核通路有关8，但是否与抑制JNK介导的非核通路有关尚不清楚。本实验用免疫印迹方法观察JNK介导的非核通路中的bcl-2、Bax的变化，发现姜黄素可以增加bcl-2的表达并抑制Bax的表达，提示其抗脑缺血再灌注损伤的机制可能与JNK介导的非核通路有关。姜黄素可能在线粒体水平上发挥作用，通过有效清除自由基、减轻线粒体膜脂质的过氧化、保护线粒体的功能来增强细胞对再灌注损伤的抵抗力9。 【参考文献】 1 武静茹,张励才,李 军,等.姜黄素对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用J.山东医药，2007，47（16）：24-25. 2 Pulsinelli WA, Br

14、ierley JB. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized ratJ. Stroke, 1979, 10(3):267-272. 3 Bonny C, Borsello T, Zine A. Targeting the JNK pathway as a therapeutic protective strategy for?nervous system diseasesJ. Rev Neurosci, 2005，16(1):57-67. 4 Hsuuw YD, Chang CK, Chan WH,

15、 et al. Curcumin prevents methylglyoxal-induced oxidative stress and apoptosis in mouse embryonic stem cells and blastocysts J . J Cell Physiol, 2005, 205(3) : 379 -386. 5 Halestrap AP, Doran E, Gillespie JP, et al. Mitochondria and cell death. Biochem Soc TransJ. 2000, 28(2):170-177. 6 陈敏娟.姜黄素研究进展及应用前景J.海峡医学, 2003,15（1）: 4-6. 7 Hossain K, Akhand AA, Kato M, et al. Arsenite induces apoptosis of murine T lymphocytes through membrane raft-linked signali