第五章酶分子修饰

1、酶分子修饰酶分子修饰 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程。从而改变酶的催化特性的技术过程。属于酶分子工程的一部分。属于酶分子工程的一部分。把酶分子中所含的金属离子换成另一种金把酶分子中所含的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法。方法。常用的金属离子常用的金属离子CaCa2+2+，MgMg2+2+，MnMn2+2+，ZnZn2+2+，CoCo2+2+，CuCu2+2+，FeFe2+2+适用性适用性本来在结构中含有金属离子的酶。本来在结构中含有金属离子的酶。（1

2、1）加入一定量的）加入一定量的EDTAEDTA（乙二胺四乙酸）等金乙二胺四乙酸）等金 属螯合物到酶液中，与酶分子中的金属离子螯合；属螯合物到酶液中，与酶分子中的金属离子螯合；（2 2）通过透析、超滤、分子筛层析等方法，从）通过透析、超滤、分子筛层析等方法，从酶液中去除酶液中去除 EDTA- EDTA-金属螯合物；金属螯合物；（3 3）加入另一种金属离子到酶液中，酶蛋白与）加入另一种金属离子到酶液中，酶蛋白与新加入的金属离子结合。新加入的金属离子结合。、阐明金属离子对酶催化作用的影响、阐明金属离子对酶催化作用的影响、提高酶活力、提高酶活力锌型蛋白酶置换成钙型蛋白酶，酶活力可提高锌型蛋白酶置换成钙

3、型蛋白酶，酶活力可提高2020-30-30倍；制成晶体，倍；制成晶体，比锌型蛋白酶结晶的酶活力提高比锌型蛋白酶结晶的酶活力提高2 2-3-3倍。倍。、增强酶稳定性、增强酶稳定性天然含铁超氧化物歧化酶中铁原子被锰取代后天然含铁超氧化物歧化酶中铁原子被锰取代后, ,酶的稳定性和抑制酶的稳定性和抑制作用发生显著改变作用发生显著改变, ,重组的含锰酶对重组的含锰酶对H2O2H2O2的稳定性显著增强的稳定性显著增强, ,对对NaH3NaH3的抑制作用的敏感性显著降低。的抑制作用的敏感性显著降低。、改变酶动力学特性、改变酶动力学特性酰化氨基酸水解酶活性部位中的锌被钴取代时酰化氨基酸水解酶活性部位中的锌被钴

4、取代时, ,酶的底物专一性和酶的底物专一性和最适最适pHpH都有改变都有改变, ,锌酶对锌酶对N-N-氯氯- -乙酰丙氨酸的最适乙酰丙氨酸的最适pHpH是是8.5,8.5,而钴酶的而钴酶的最适最适pHpH是是7.0,7.0,并且对并且对N-N-氯氯- -乙酰丙氨酸等三种底物的活力降低，乙酰丙氨酸等三种底物的活力降低，m m增大，亲和力降低。增大，亲和力降低。 利用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，利用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的催使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。化特性的方法。水溶性大分子：右旋糖酐、聚乙二醇（水溶性大分子

5、：右旋糖酐、聚乙二醇（PEGPEG）、）、肝素、蔗糖聚合物等肝素、蔗糖聚合物等、修饰剂的选择、修饰剂的选择一、大分子结合修饰的方法一、大分子结合修饰的方法 大分子在使用前一般需经过活化，活化基团大分子在使用前一般需经过活化，活化基团才能在一定条件下与酶分子某侧链基团反应。才能在一定条件下与酶分子某侧链基团反应。、修饰剂的活化、修饰剂的活化 酶催化剂能力本质上是由其特定的空间结构特别酶催化剂能力本质上是由其特定的空间结构特别是其活性中心的特定构象所决定是其活性中心的特定构象所决定水溶性大分子通过共价键与酶分子结合后可使酶水溶性大分子通过共价键与酶分子结合后可使酶的空间结构发生某些改变，使酶的活性

6、中心更有的空间结构发生某些改变，使酶的活性中心更有利于和底物结合并形成准确的催化部位，使酶活利于和底物结合并形成准确的催化部位，使酶活力提高。力提高。1 1分子核糖核酸酶与分子核糖核酸酶与6.56.5分子右旋糖酐结合，活力分子右旋糖酐结合，活力提高提高2.252.25倍。倍。二、大分子结合修饰的作用二、大分子结合修饰的作用酶的稳定性较低是普遍存在的。采用大分子与酶的稳定性较低是普遍存在的。采用大分子与酶结合，形成复合物，就可起到保护酶的天然酶结合，形成复合物，就可起到保护酶的天然构象的作用，从而增加酶的稳定性。构象的作用，从而增加酶的稳定性。表表5-1 天然天然SOD与修饰后与修饰后SOD在人

7、血浆中的半衰期在人血浆中的半衰期 酶酶 半衰期半衰期天然天然SOD右旋糖酐右旋糖酐-SODFicoll（低分子量）低分子量）-SODFicoll（高分子量）高分子量）-SOD聚乙二醇聚乙二醇-SOD 6min 7h 14h 24h 35h抗原抗原能引起体内产生抗体的物质。能引起体内产生抗体的物质。抗体抗体当外源蛋白非经口进入人或动物体内后，体当外源蛋白非经口进入人或动物体内后，体内血清中就可能出现与此外源蛋白特异结合的物内血清中就可能出现与此外源蛋白特异结合的物质称之为抗体。质称之为抗体。当酶非经口（如注射）进入人体后，往往会成为当酶非经口（如注射）进入人体后，往往会成为一种抗原，刺激体内产生

8、抗体。当这种酶再次注一种抗原，刺激体内产生抗体。当这种酶再次注射进体内时，抗体就会与作为抗原的酶特异地结射进体内时，抗体就会与作为抗原的酶特异地结合，使酶失去催化功能。用合，使酶失去催化功能。用PEGPEG修饰色氨酸酶可修饰色氨酸酶可完全消除该酶的抗原性。完全消除该酶的抗原性。采用一定的方法使酶蛋白的侧链基团发生改变，采用一定的方法使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶的催化特性的修饰方法。从而改变酶的催化特性的修饰方法。用于研究酶分子结构与功能：用于研究酶分子结构与功能：（）荧光试剂修饰，了解酶水溶液中构象；（）荧光试剂修饰，了解酶水溶液中构象；（）各基团对酶的影响，必需基团；（）各基团对酶

9、的影响，必需基团；（）某基团数量；（）某基团数量；（）改变酶性能（）改变酶性能 其侧链功能基团有氨基、羧基、巯基、咪唑其侧链功能基团有氨基、羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基等，基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基等，这些基团可组成各种副键对蛋白质空间结构的形这些基团可组成各种副键对蛋白质空间结构的形成和稳定起重要作用。这些功能基团发生改变，成和稳定起重要作用。这些功能基团发生改变，引起副键改变，使空间结构发生某些变化，从而引起副键改变，使空间结构发生某些变化，从而引起酶特性和功能的改变。引起酶特性和功能的改变。（1）氨基修饰氨基修饰（2）羧基修饰羧基修饰（）巯基修饰巯基

10、修饰（）（）胍基修饰胍基修饰（5）酚基修饰酚基修饰 （）咪唑基修饰（）咪唑基修饰（）吲哚基修饰（）吲哚基修饰（）分子内交联分子内交联侧链基团修饰方法侧链基团修饰方法赖氨酸的赖氨酸的 -NH2以非质子化形式存在时以非质子化形式存在时亲核反应活性高，易被选择性修饰。亲核反应活性高，易被选择性修饰。三硝基苯磺酸（三硝基苯磺酸（TNBS）是是非常有效的氨基修饰剂。非常有效的氨基修饰剂。1、氨基的烷基化、氨基的烷基化反应式反应式2、氰酸盐使氨基甲氨酰化，离子小，、氰酸盐使氨基甲氨酰化，离子小，易接近要修饰的基团。易接近要修饰的基团。3、磷酸吡哆醛（、磷酸吡哆醛（PLP）4、多肽链多肽链N-末端残基的化学

11、修饰：用于蛋末端残基的化学修饰：用于蛋白质序列分析。有白质序列分析。有2，4二硝基氟苯二硝基氟苯（DNFB）法（法（sanger试剂）、丹磺酰氯试剂）、丹磺酰氯（DNS）法、苯异硫氰酸酯（法、苯异硫氰酸酯（PITC）法。法。碳二亚胺修饰酶的羧基已成为最普遍的标准方法，碳二亚胺修饰酶的羧基已成为最普遍的标准方法，条件温和。条件温和。反应式反应式+巯基在维持亚基间相互作用和酶催化过程中巯基在维持亚基间相互作用和酶催化过程中起重要作用，具很强的亲核性，在含半胱氨起重要作用，具很强的亲核性，在含半胱氨酸的酶分子中是最易反应的侧链基团。酸的酶分子中是最易反应的侧链基团。1、烷基化试剂；、烷基化试剂；2、

12、马来酰亚胺；、马来酰亚胺；3、有机汞试剂；、有机汞试剂；4、5-5-二硫代二硫代-双（双（2-硝基苯甲酸硝基苯甲酸）（DTNBDTNB，EllmanEllman试剂）试剂） 巯基修饰剂巯基修饰剂反应式反应式具两个邻位羰基的化合物，如丁二酮等，是修饰具两个邻位羰基的化合物，如丁二酮等，是修饰精氨酸残基的重要试剂；精氨酸残基的重要试剂；精氨酸残基在结合带有阴离子底物的酶活性中心精氨酸残基在结合带有阴离子底物的酶活性中心部位起重要作用。部位起重要作用。反应式反应式1 1、碘化法、碘化法2 2、硝化法、硝化法3 3、琥珀酰化法、琥珀酰化法酪氨酸残基上含有酚基，酚基经修饰后，引入负酪氨酸残基上含有酚基，

13、酚基经修饰后，引入负电荷，增加了对正电荷底物的结合力。电荷，增加了对正电荷底物的结合力。修饰方法：修饰方法：含两个反应活性部位的含两个反应活性部位的双功能基团，可在相隔双功能基团，可在相隔较近的两个氨基酸残基较近的两个氨基酸残基之间或其它分子间发生之间或其它分子间发生交联反应，可使酶分子交联反应，可使酶分子空间构象更加稳固。空间构象更加稳固。有同型双功能试剂、异型双功能试剂。有同型双功能试剂、异型双功能试剂。酶的催化功能主要决定于酶的活性中心构象酶的催化功能主要决定于酶的活性中心构象肽段作用肽段作用（1 1）在活性中心部位的，起催化作用；）在活性中心部位的，起催化作用；（2 2）在活性中心以外

14、部位，维持酶的空间构象。）在活性中心以外部位，维持酶的空间构象。肽链被水解后的情况肽链被水解后的情况（1 1）酶活性中心破坏，酶失去催化功能）酶活性中心破坏，酶失去催化功能（2 2）仍可维持酶活性中心的完整构象，酶活力保持不）仍可维持酶活性中心的完整构象，酶活力保持不变或损失不多变或损失不多（3 3）有利于活性中心与底物的结合并且形成准确的催）有利于活性中心与底物的结合并且形成准确的催化部位，酶催化功能增强或酶活力提高化部位，酶催化功能增强或酶活力提高l利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的结构及其空间结构

15、发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。特性和功能的方法。l酶蛋白主链修饰主要是靠酶切酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/ /酶原激活法。酶原激活法。a a、胃蛋白酶原的激活、胃蛋白酶原的激活 HCl胃胃蛋蛋白白酶酶原原pH1.52（从从N N端端失失去去4 44 4个个氨氨基基酸酸残残基基）自自身身激激活活胃胃蛋蛋白白酶酶b b、胰蛋白酶原（、胰蛋白酶原（trypsinogentrypsinogen）的激活）的激活 将酶分子肽链上的某一个将酶分子肽链上的某一个氨基酸置换成另一个氨基酸，氨基酸置换成另一个氨基酸，从而改变酶的催化特性的修饰从而改变酶的催化特性的修饰方法。方法。 置换的置换的氨基酸氨

16、基酸催化剂：酪氨酰催化剂：酪氨酰- -tRNAtRNA合成酶。合成酶。其第其第5151位苏氨酸换成脯氨酸，对位苏氨酸换成脯氨酸，对ATPATP的亲和性提的亲和性提高近高近100100倍，酶活力提高倍，酶活力提高2525倍。倍。例例酪氨酸酪氨酸 + tRNA酪氨酰酪氨酰-tRNA酪氨酰酪氨酰-tRNA合成酶合成酶、提高酶活力、提高酶活力、增强酶的稳定性。、增强酶的稳定性。、酶专一性改变、酶专一性改变一、一、-干扰素的稳定性干扰素的稳定性（修饰后低温保存半年，活性不变）。（修饰后低温保存半年，活性不变）。干扰素含干扰素含3 3个半胱氨酸，其中个半胱氨酸，其中2 2个的巯基个的巯基连成二硫键，另一个

17、（连成二硫键，另一个（Cys-17Cys-17）游离游离, ,易与另一个干扰素的游离巯基结合失去易与另一个干扰素的游离巯基结合失去活性。用丝氨酸置换之活性。用丝氨酸置换之, ,使干扰素不生使干扰素不生成二聚体成二聚体, ,大大提高其稳定性。大大提高其稳定性。例例2原理原理方法方法 1、化学修饰法、化学修饰法、定点突变法、定点突变法蛋白质工程蛋白质工程通过改造蛋白质相对应的基因中的碱通过改造蛋白质相对应的基因中的碱基排列次序，或设计合成新的基因，将它克隆到基排列次序，或设计合成新的基因，将它克隆到寄主细胞中，通过基因表达而获得具有新的特性寄主细胞中，通过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质的技术过

18、程。的蛋白质的技术过程。1、新蛋白质工程结构的设计、新蛋白质工程结构的设计2、突变基因的核苷酸序列的确定、突变基因的核苷酸序列的确定3、突变基因的获得、突变基因的获得4、新蛋白质的产生、新蛋白质的产生蛋白质工程的主要步骤蛋白质工程的主要步骤实验操作大致步骤实验操作大致步骤(1)先测定酶的一级结构先测定酶的一级结构(2)用用X射线衍射分析测定其三维结构射线衍射分析测定其三维结构(3a)根据结构信息选择突变部位根据结构信息选择突变部位,即选定哪一个氨基即选定哪一个氨基酸残基要被取代酸残基要被取代;选选46个氨基酸残基的寡肽序列个氨基酸残基的寡肽序列,其其间含待取代的氨基酸残基间含待取代的氨基酸残基

19、(3b)用化学法合成由用化学法合成由1218个碱基组成并为所选寡肽的氨个碱基组成并为所选寡肽的氨基酸序列编码的核苷酸序列基酸序列编码的核苷酸序列,作为定位诱变的引物作为定位诱变的引物(4)找到找到(构建构建)单股质粒单股质粒,含有为所要蛋白质编码的基因含有为所要蛋白质编码的基因,作为定点突变的模板作为定点突变的模板(7)将这两个基因分离并克隆将这两个基因分离并克隆,最后产物是细胞转化突最后产物是细胞转化突变型变型,能合成突变体蛋白质能合成突变体蛋白质,与母体蛋白质仅有与母体蛋白质仅有1个氨个氨基酸的差别基酸的差别,这个氨基酸就是事先选定的突变部位这个氨基酸就是事先选定的突变部位.(6)将异质双

20、链质粒引入宿主细胞将异质双链质粒引入宿主细胞,(如如E.coli).转化为两个同质双链质粒转化为两个同质双链质粒,一个含的基因是天一个含的基因是天然蛋白质编码的然蛋白质编码的,另一个是为突变体编码的另一个是为突变体编码的(5)将引物与单链模板将引物与单链模板DNA配对配对,用各种用各种DNA聚聚合酶和合酶和DNA连接酶将引物延长连接酶将引物延长,形成互补链形成互补链,得得到共价闭合的双链到共价闭合的双链DNA,也叫异质双链质粒也叫异质双链质粒通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发生某些通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。改变，从而改变酶的某些特性

21、和功能的方法。特点特点（1 1）不改变酶的组成单位和基团；）不改变酶的组成单位和基团；（2 2）酶分子中的共价键不发生改变；）酶分子中的共价键不发生改变；（3 3）副键发生某些变化和重排。）副键发生某些变化和重排。效果效果（1 1）改变底物特异性。多肽酶经高压处理，有利）改变底物特异性。多肽酶经高压处理，有利于肽的合成反应，降低了水解反应的能力于肽的合成反应，降低了水解反应的能力（2 2）提高酶活力，降低最适温度。高压处理纤维）提高酶活力，降低最适温度。高压处理纤维素酶，素酶， 30 30-40-40O OC C，酶活提高酶活提高10%10%。、酶的活性中心研究、酶的活性中心研究、酶空间结构研

22、究、酶空间结构研究、酶作用机制研究、酶作用机制研究（）亲和标记法（）亲和标记法（）差示标记法（）差示标记法（）氨基酸置换法（）氨基酸置换法（）核苷酸置换法（）核苷酸置换法、降低或者消除酶抗原性、降低或者消除酶抗原性、增强医药用酶的稳定性、增强医药用酶的稳定性、提高工业用酶的活力、提高工业用酶的活力、增强工业用酶的稳定性、增强工业用酶的稳定性、改变酶的动力学特性、改变酶的动力学特性抗体是和抗原结合的物质。抗体是和抗原结合的物质。抗体与靶分子精确匹配。抗体与靶分子精确匹配。产生高度特异性和亲和性。产生高度特异性和亲和性。免疫系统可以产生免疫系统可以产生1081010个不同的抗体分个不同的抗体分子（

23、多样性子（多样性 ） 抗体结构抗体结构 抗体分子是由抗体分子是由两条轻链两条轻链( L链链)和和两条重链两条重链(H链链)通过链间二通过链间二硫键连接而成硫键连接而成的四肽链结构。的四肽链结构。能否利用抗体的这些特性将抗体能否利用抗体的这些特性将抗体开发成象酶那样的催化剂呢？开发成象酶那样的催化剂呢？1969年，年， Jentcks根据根据Panling的化学反应过渡的化学反应过渡态理论预言，用过渡态类似物，作为半抗原，态理论预言，用过渡态类似物，作为半抗原，产生的抗体，产生的抗体，该抗体该抗体具有酶催化反应的具有酶催化反应的基本特基本特征。征。1986年年Science同时发表了两篇来自由同

24、时发表了两篇来自由Lemer和和Schultz分别领导的两个研究组的发现分别领导的两个研究组的发现具有具有酶催化能力的抗体酶催化能力的抗体研究报告，揭开研究抗研究报告，揭开研究抗体酶的体酶的热潮热潮。取得的成果：取得的成果：天然酶所催化的天然酶所催化的6种种酶促反应酶促反应数十种类型数十种类型的常规反应的抗体酶。包括酯、的常规反应的抗体酶。包括酯、羧酸和酰胺键的水解，酰胺形成，光诱导裂羧酸和酰胺键的水解，酰胺形成，光诱导裂解和聚合，酯交换，等等。解和聚合，酯交换，等等。 抗体酶（抗体酶（abzyme）：是抗体的高度选择性和酶）：是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一的高

25、效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性，也叫催化抗体予了酶的属性，也叫催化抗体。 特点：特点：1、反应、反应专一性专一性相当于或超过自然酶反应的专一相当于或超过自然酶反应的专一性，性，2、催化速度有的可达到自然酶催化的水平。但、催化速度有的可达到自然酶催化的水平。但一般来说比非催化反应快一般来说比非催化反应快 102106倍，比天然倍，比天然酶催化反应酶催化反应速度慢速度慢，仅为它的，仅为它的 10-4-10-2。革命尚未成功，同志仍需努力。革命尚未成功，同志仍需努力。 二、抗体酶的制备方法二、抗体酶的制

26、备方法 1. 诱导法诱导法 l 以以Pauling的稳定过渡态理论为指导，的稳定过渡态理论为指导，即酶的催化在于能结合底物产生过渡态，降即酶的催化在于能结合底物产生过渡态，降低能障（反应的活化能）。低能障（反应的活化能）。l 以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互补构象的抗体，使其具有催化活性，可观互补构象的抗体，使其具有催化活性，可观察到抗体催化相应底物发生化学反应。察到抗体催化相应底物发生化学反应。 用设计好的半抗原，通过间隔链与载用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行然后对

27、动物进行免疫免疫，取免疫动物的脾细，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞分泌单克胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞分泌单克隆抗体，经筛选和纯化，得到抗体酶。隆抗体，经筛选和纯化，得到抗体酶。例例 ： Schultz研究小组以研究小组以羧酸二酯水解反应羧酸二酯水解反应的的过渡态类似物过渡态类似物对硝基苯磷酰胆碱对硝基苯磷酰胆碱作为半抗原，诱作为半抗原，诱导产生单克隆抗体，经过筛选找到一株导产生单克隆抗体，经过筛选找到一株MOPC167。使水解反应速度加快使水解反应速度加快 12 000倍。倍。 2. 抗体结合部位修饰法抗体结合部位修饰法 以底物为半抗原所产生的抗体应当以底物为半抗原所产生的抗体应当具有底物结合部位，然后在此抗体的结具有底物结合部位，然后在此抗体的结合部位上引入催化基团。如果引入的催合部位上引入催化基团。如果引入的催化基团与底物结合部位取向正确、空间化基团与底物结合部位取向正确、空间排布恰到好处，则应产生高活