清华大学微生物学第六生长繁殖及控制

1、第三节第三节 影响微生物生长的主要因素影响微生物生长的主要因素三、三、PH 值值 一、温一、温 度度 二、氧气二、氧气一、温一、温 度度一、一、 温温 度度生长温度三基点生长温度三基点最适生长温度：最适生长温度： 某菌代时最短或生长速率最某菌代时最短或生长速率最高时的培养温度。高时的培养温度。 最适生长温度并非一切生理最适生长温度并非一切生理过程的最适温度过程的最适温度一、一、 温温 度度二、氧气二、氧气微生物与氧的关系微生物与氧的关系二、氧气二、氧气为什么厌氧菌远离氧气呢？好氧微生物可以通过呼吸产生能量，好氧微生物可以通过呼吸产生能量，满足机体的需要，但氧会使一切生满足机体的需要，但氧会使一

2、切生物产生有毒害作用的代谢产物，如物产生有毒害作用的代谢产物，如超氧阴离子自由基与超氧阴离子自由基与H2O2超氧阴离子自由基的特点？超氧阴离子自由基的特点？ 带负电，兼有分子、离子性质带负电，兼有分子、离子性质性质及不稳定，化学反应能力极强性质及不稳定，化学反应能力极强可破坏细胞内各种大分子和膜结构可破坏细胞内各种大分子和膜结构或形成其他活性氧化物或形成其他活性氧化物超氧阴离子自由基的特点？超氧阴离子自由基的特点？ 为什么只有厌氧菌害怕氧气呢？为什么只有厌氧菌害怕氧气呢？ 三、三、 PH 微生物生长过程中机体内发生的微生物生长过程中机体内发生的绝大多数的反应是酶促反应，而酶促绝大多数的反应是酶

3、促反应，而酶促反应都有一个最适反应都有一个最适pH范围，在此范范围，在此范围内只要条件适合，酶促反应速率最围内只要条件适合，酶促反应速率最高，微生物生长速率最大高，微生物生长速率最大 因此微生物生长也有一个最适生因此微生物生长也有一个最适生长的长的pH范围。范围。 三、三、 PH三、三、 PH三、三、 PH1.微生物细胞内环境的微生物细胞内环境的PH是否稳定？是否稳定？2.微生物的生命活动会改变培养基或微生物的生命活动会改变培养基或外环境的外环境的PH吗？吗？三、三、 PH2.微生物的生命活动会改变培养基或外环境的微生物的生命活动会改变培养基或外环境的PH吗？吗？三、三、PH如何在发酵过程中及

4、时调节如何在发酵过程中及时调节pH？第四节 微生物培养法概论良好微生物培养装置的条件：良好微生物培养装置的条件： 应在提供丰富而均匀的营养物质的应在提供丰富而均匀的营养物质的基础上，能保证微生物获得适宜的温度基础上，能保证微生物获得适宜的温度和对绝大多数微生物所必需的良好通气和对绝大多数微生物所必需的良好通气条件（只有少数厌氧菌例外），此外，条件（只有少数厌氧菌例外），此外，还要为微生物提供一个适宜的物理化学还要为微生物提供一个适宜的物理化学条件和严防杂菌的污染等。条件和严防杂菌的污染等。 第四节 微生物培养法概论微生物培养技术的发展：微生物培养技术的发展：从少量培养发展到大规模培养；从浅层培

5、养发展从少量培养发展到大规模培养；从浅层培养发展到厚层（固体）或深层（液体）培养；从以固体到厚层（固体）或深层（液体）培养；从以固体培养技术为主发展到以液体培养技术为主；从静培养技术为主发展到以液体培养技术为主；从静止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养；从止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养；从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养；从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养；从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化的细胞集利用分散的微生物细胞发展到利用固定化的细胞集团；从单纯利用微生物细胞到大量培养、利用高团；从单纯利用微生物细胞到大量培养、利用高等动、植物细胞；从单菌发酵发展到混菌发酵；等

6、动、植物细胞；从单菌发酵发展到混菌发酵；从利用野生菌种发展到利用变异株以及从利用野生菌种发展到利用变异株以及“工程工程菌菌”；低密度培养到高密度培养低密度培养到高密度培养等等。等等。 第四节 微生物培养法概论一、实验室培养法一、实验室培养法二、生产实践中培养微生物的装置二、生产实践中培养微生物的装置第四节 微生物培养法概论一、实验室培养法（一）固体培养法（一）固体培养法（二）液体培养法（二）液体培养法一、实验室培养法高层琼脂柱高层琼脂柱厌氧培养皿厌氧培养皿亨盖特滚管技术亨盖特滚管技术厌氧罐厌氧罐厌氧手套箱厌氧手套箱固体培养法固体培养法斜面、平板、斜面、平板、克氏扁瓶、茄子瓶克氏扁瓶、茄子瓶厌氧

7、菌培养厌氧菌培养好氧菌培养好氧菌培养一、实验室培养法克氏扁瓶克氏扁瓶 茄子瓶茄子瓶一、实验室培养法（1）高层琼脂柱）高层琼脂柱 用加有还原剂的固体或半固体培用加有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中，以培养相应的厌养基装入试管中，以培养相应的厌氧菌。氧菌。 在这种培养基中，越是深层，在这种培养基中，越是深层，其氧化还原势越低，因而越有利于其氧化还原势越低，因而越有利于厌氧菌的生长。厌氧菌的生长。 （2）厌氧培养皿厌氧培养皿 利用皿盖去创造一个狭窄空间，加上使用还原性培养基而达到无氧培养的目的（例如Brewer皿，见图6-10）；利用皿底有两个相互隔开的空间，其中之一放焦性没食子酸，另一则放Na

8、OH溶液，在皿盖平板上接入待培养的厌氧菌后，立即密闭。经摇动，使焦性没食子酸与NaOH溶液接触，发生吸氧反应，从而造成无氧环境（如SPray皿或Bray皿一、实验室培养法 （3）亨盖特滚管技术）亨盖特滚管技术原理：原理：利用除氧铜柱来制备高纯氮，并用高纯氮驱除利用除氧铜柱来制备高纯氮，并用高纯氮驱除小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和贮存，小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和贮存，以及菌种的接种、培养、观察、分离、移种和保藏等以及菌种的接种、培养、观察、分离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧条件下，从而保证了这类严格过程始终处于高度无氧条件下，从而保证了这类严格厌氧菌的存活。厌

9、氧菌的存活。一、实验室培养法 优点：优点：试管内壁有较大的表面积试管内壁有较大的表面积 试管口面积、试管腔体积极小试管口面积、试管腔体积极小有利于阻止氧与厌氧菌的接触有利于阻止氧与厌氧菌的接触一、实验室培养法（4）厌氧罐技术）厌氧罐技术一、实验室培养法（4）厌氧罐技术这是一种常规的不很严格的厌氧技术，可用于培养多数厌氧菌。在罐内一般可放10个常用的培养皿（直径9cm）或任何液体培养的试管。使用时，先装入待培养的对象，然后密闭罐盖，接着可采用抽真空灌氮抽真空灌氮抽真空灌混合气（N2 CO2 H2=80 10 10，V/V）。这样，罐内少量剩余氧在钯催化剂作用下，可被灌入的混合气中的H2还原成水，

10、从而造成很高的无氧状态。这时指示剂美蓝被还原成无色。 一、实验室培养法（4）厌氧罐技术目前，国际上盛行方便的“GasPak”产气袋商品，把袋口剪开一角并加适量水后，即会自动放出足够的CO2和H2。这就是内源式的氢气和二氧化碳源。一、实验室培养法（4）厌氧罐技术特点：厌氧菌培养过程处于无氧状态 培养基配制、接种、观察 分离、保藏等过程无法保证一、实验室培养法（5）厌氧手套箱实验室研究厌氧菌的三大重要技术:厌氧手套箱技术厌氧罐技术亨盖特滚管技术一、实验室培养法浅层液体静止培养摇瓶振荡培养通入加压空气机械搅拌等液体培养法1.好氧菌的液体培养 如何提高氧的供应？一、实验室培养法液体培养法实验室常用好氧

11、菌培养法：试管液体培养三角瓶浅层液体培养摇瓶振荡培养台式发酵罐一、实验室培养法摇瓶振荡培养： 即将三角瓶内培养液用8层纱布包住瓶口，以取代一般的棉花塞，同时降低瓶内的装液量，把它放到往复式或旋转式摇床上作有节奏的振荡，以达到提高溶氧量的目的。此法是荷兰的AJKluyver等于1933年最早试用，目前仍广泛地用于菌种的筛选以及进行生理、生化和发酵等试验中。 一、实验室培养法（4）台式发酵罐 体积一般为几升至几十升，并有多种自动控制和记录装置。现成的商品种类很多，用作发酵研究十分方便。 平行发酵罐发酵罐 第四节 微生物培养法概论二、生产实践中培养微生物的装置（一）固态培养法1. 好氧菌的曲法培养2

12、. 厌氧菌的堆积培养法二、生产实践中培养微生物的装置（一）固态培养法1. 好氧菌的曲法培养 好氧菌的固体培养方法都是将接过种的固体基质薄薄地摊铺在容器表面，这样，既可使微生物获得充分的氧气，又可让微生物在生长过程中产生的热量及时释放，这就是曲法培养的基本原理。 第四节 微生物培养法概论二、生产实践中培养微生物的装置（一）固态培养法第四节 微生物培养法概论二、生产实践中培养微生物的装置（一）固态培养法根据制曲的容器形状和规模的大小，可把各种制曲方法分成瓶曲、袋曲（用塑料袋制曲）、盘曲（用木盘制曲）帘子曲（用竹帘子制曲）、转鼓曲（用木质空心转鼓，不断转动制曲）和通风曲等。 第四节 微生物培养法概论

13、二、生产实践中培养微生物的装置（一）固态培养法第四节 微生物培养法概论（一）固态培养法2.厌氧菌的堆积培养法第四节 微生物培养法概论（一）固态培养法2.厌氧菌的堆积培养法二、生产实践中培养微生物的装置（二）液体培养法好氧菌的培养（1）浅盘培养（2）深层液体通气培养 发酵罐二、生产实践中培养微生物的装置 发酵罐（fermenter） 是一种钢质圆筒形直立容器，有扁球形的底和盖，其高与直径之比一般为1 22.5。 容积可大可小，大型发酵罐的容积在50500m3间，最大的为英国用于甲醇蛋白生产的巨型发酵罐，其有效容积达1500m3。 二、生产实践中培养微生物的装置 发酵罐啤酒发酵罐大型发酵罐（二）液

14、体培养法二、生产实践中培养微生物的装置厌氧菌大规模的液体培养装置 迄今为止，能作大规模液体培养的厌氧菌仅局限于丙酮丁醇梭菌的丙酮丁醇发酵一种。由于该菌是严格厌氧菌，故可省略通气、搅拌设备，简化工艺过程，还能大大节约能源的消耗。由于厌氧发酵罐不必安装通气、搅拌装置，所以其体积一般可明显大于有通气、搅拌设备的发酵罐（国际上厌氧发酵罐的体积可达到2000m3），从而提高了生产效率。 第五节 有害微生物的控制第五节 有害微生物的控制灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。第五节

15、有害微生物的控制消毒：是一种采用较温和的理化因素，仅杀死消毒：是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。而对被消毒的物体基本无害的措施。例如一些常用的对皮肤、水果、饮用水例如一些常用的对皮肤、水果、饮用水进行药剂消毒的方法；进行药剂消毒的方法；对啤酒、牛奶、果汁和酱油等对啤酒、牛奶、果汁和酱油等进行消毒处理的巴氏消毒法，等进行消毒处理的巴氏消毒法，等 （二）消毒（二）消毒（disinfection） 第五节 有害微生物的控制（三）防腐（antisepsis） 防腐就是利用某种理化因素完全抑制

16、霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。第五节 有害微生物的控制防腐的措施很多，主要有： （1）低温 利用4以下的各种低温 （2）缺氧 在密闭容器中加入除氧剂 （3）干燥 晒干或红外线干燥等 （4）高渗 盐腌和糖渍等 （5）高酸度 泡菜 （6）防腐剂 苯甲酸、尼泊金、山梨酸等 第五节 有害微生物的控制（四）化疗（四）化疗（chemotherapy） 化疗即化学治疗。它是利用具有高度化疗即化学治疗。它是利用具有高度选择毒力（选择毒力（selectivetoxicity，即对病原菌，即对病原菌具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学具有高度毒力而对宿主无显著毒性）的化学物质来抑制宿主

17、体内病原微生物的生长繁殖，物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。借以达到治疗该传染病的一种措施。二、物理灭菌因素的代表 高温 高温的致死作用，主要是由于它使微生物的高温的致死作用，主要是由于它使微生物的蛋白质和核酸等重要蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性、生物高分子发生变性、破坏破坏，例如它可使核酸发生脱氨、脱嘌呤或，例如它可使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解，以及破坏细胞膜上的类脂质成分等。降解，以及破坏细胞膜上的类脂质成分等。 （一）高温杀菌作用的种类（一）高温杀菌作用的种类 二、物理灭菌因素的代表 高温1、干热灭菌法、干热灭菌法火焰灼烧（最彻底）火焰灼烧（最

18、彻底）烘箱内热空气灭菌烘箱内热空气灭菌干热灭菌干热灭菌温度：温度：150-170 时间：时间：1-2h对象：金属器械、玻璃器皿等对象：金属器械、玻璃器皿等1、干热灭菌法、干热灭菌法细菌的芽孢是耐热性最强的生命形式，所以，干热细菌的芽孢是耐热性最强的生命形式，所以，干热灭菌时间常以几种有代表性的细菌芽孢的耐热性作灭菌时间常以几种有代表性的细菌芽孢的耐热性作参考标准参考标准 2、湿热灭菌、湿热灭菌相同温度和作用时间下，相同温度和作用时间下，湿热比干热灭菌更好？湿热比干热灭菌更好？更易于传递热量；更易于传递热量；更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构 湿热对一般营养

19、体和孢子的杀灭条件：湿热对一般营养体和孢子的杀灭条件：多数细菌和真菌的营养细胞：多数细菌和真菌的营养细胞：在在60左右处理左右处理5-10分钟；分钟；酵母菌和真菌的孢子：用酵母菌和真菌的孢子：用80以上温度处理；以上温度处理；细菌的芽孢：细菌的芽孢：121处理处理15分钟以上；分钟以上；2、湿热灭菌、湿热灭菌2、湿热灭菌、湿热灭菌对象：牛奶、啤酒、果酒或酱油等对象：牛奶、啤酒、果酒或酱油等For :高温会破坏食品的营养与风味高温会破坏食品的营养与风味巴氏消毒法巴氏消毒法具具体体方方法法低温维持法：只要在低温维持法：只要在63下维持下维持30min高温瞬时法：只要在高温瞬时法：只要在7285下维

20、持下维持15s超高温法：只要超高温法：只要120140加热加热24秒秒 煮沸消毒煮沸消毒 一般用于饮用水的消毒（一般用于饮用水的消毒（100下数分钟）。下数分钟）。 对于某些培养基，由于高压蒸汽灭对于某些培养基，由于高压蒸汽灭菌会破坏某些营养成分，可用间隙灭菌会破坏某些营养成分，可用间隙灭菌法灭菌，即流通蒸汽菌法灭菌，即流通蒸汽(或蒸煮或蒸煮)反复灭反复灭菌几次，菌几次，间隙灭菌法间隙灭菌法 第一次蒸煮后杀死微生物营养体，冷第一次蒸煮后杀死微生物营养体，冷却，培养过夜，芽孢萌发，又第二次蒸煮却，培养过夜，芽孢萌发，又第二次蒸煮，杀死营养体。这样反复，杀死营养体。这样反复23次就可以完次就可以完

21、全杀死营养体和芽孢，也可保持某些营养全杀死营养体和芽孢，也可保持某些营养物质不被破坏。物质不被破坏。 常规加压蒸气灭菌法常规加压蒸气灭菌法2. 湿热灭菌法湿热灭菌法（2）加压法）加压法连续加压蒸气灭菌法连续加压蒸气灭菌法2. 湿热灭菌法湿热灭菌法加压法加压法 将待灭菌的物件放置在盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅（或家用压力锅）内。把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的空气彻底驱尽后将锅密闭。再继续加热就会使锅内的蒸气压逐渐上升，从而温度也上升到100以上。2. 湿热灭菌法湿热灭菌法加压法加压法 为达到良好的灭菌效果，一般要求温度应达到121（压力为1kgcm2或15磅英寸2），时间维持1520分钟，也可

22、采用在较低的温度（115，即0.7kgcm2或10磅英寸2）下维持35分钟的方法。2. 湿热灭菌法湿热灭菌法加压法加压法 此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。 连续加压蒸气灭菌法连续加压蒸气灭菌法2. 湿热灭菌法湿热灭菌法加压法加压法135140下维持下维持515s优点优点：提高原料利用率、产品产量和质量提高原料利用率、产品产量和质量 提高发酵罐利用率提高发酵罐利用率 提高锅炉利用率提高锅炉利用率 宜于自动化操作宜于自动化操作适用范围：适用范围：大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用 2. 湿热灭菌法湿热灭菌法加压法加压法利用温度进行杀菌的定量指标？利用