猴头菇多糖的提取与脱蛋白工艺生物技术及应用

1、江苏农林职业技术学院 毕 业 设 计（论 文）SNL/QR7.5.4-3 猴头菇多糖的提取与脱蛋白工艺专 业 生物技术及应用 学生姓名 沙媛媛 班 级 06生物技术及应用（2） 学 号 061401214 指导教师 谢春芹 完成日期 2009-6-5 7附1：成绩评议学号061401214姓名 沙媛媛 题目 猴头菇多糖的提取与脱蛋白工艺 指导教师建议成绩： 评阅教师建议成绩： 答辩小组建议成绩： 院答辩委员会评阅意见及评定成绩：答辩委员会主任签字（盖章）： 年 月 日附2：毕业设计（论文）任务书姓名沙媛媛学号061401214班级06生物技术及用应（2）题目猴头菇多糖的提取与脱蛋白工艺设计(论

2、文)主要内容猴头菇的重要作用猴头菇多糖的结构和生物活性猴头菇多糖的提取（热水浸提的方法和步骤，实验结果的讨论）猴头菇多糖的脱蛋白（sevag法除蛋白的方法步骤和实验结果的分析讨论）重点研究问题猴头菇多糖的热水浸提的方法和sevag法脱蛋白的方法。主要技术指标 使用热水浸提方法提取猴头菇多糖更有效，使用sevag法脱蛋白方法更方便我们使用。其它要说明的问题猴头菇多糖的提取量不高，脱蛋白不彻底，总的提取纯化工艺流程复杂等。指导老师意见 指导教师签字： 年 月 日附3：指导教师意见 对论文的简短评价：1.指出论文存在的问题及错误2.对创造性工作评价3.建议成绩 优 良 中 及格 不及格 指导教师签字

3、 年 月 日评阅教师意见 对论文的简短评价：1.指出论文存在的问题及错误2.对创造性工作评价3.建议成绩 优 良 中 及格 不及格 评阅教师签字 年 月 日附4：答辩小组评议意见学号061401214姓名 沙媛媛 题目 猴头菇多糖的提取与脱蛋白工艺 答辩小组意见： 1、对论文的评价2.建议成绩等级 优 良 中 及格 不及格3.需要说明的问题 答辩小组长签字 年 月 日沙媛媛：猴头菇多糖的分离与脱蛋白工艺摘要：猴头菇是药用兼用菌而且具有很好的保健效果，采取热水浸提和sevag法是提取和除蛋白的最优工艺，多糖生物活性的作用和重要性，可作为药用保健等工厂化生产，广阔的前景。关键词：作用；热水浸提；s

4、evag法；生物活性；前景。Abstract: a combination of medicinal fungi Hericium is good health and has the effect of hot water extraction and sevag taken is in addition to protein extraction and the optimal process, the role of biologically active polysaccharides and importance, can be used as medicinal health, s

5、uch as factory production, and broad prospects.Keywords: role; hot water extraction; sevag law; biological activity; prospects.目录1猴头菇的作用介绍12猴头菇多糖结构和生物活性1 2.1猴头菇多糖的结构12.2猴头菇多糖的生物活性13 猴头菇多糖的提取 2 3.1 热水浸提猴头菇实验的步骤和方法2 3.1.1 材料和设备2 3.1.2 实验的原理2 3.1.3 热水浸提操作步骤24 猴头菇多糖的分离纯化3 4.1 sevag法除蛋白的方法步骤45小结46参考文献67致

6、谢7猴头菇多糖的提取与脱蛋白工艺猴头菇又名猴头菌、花菜菌等，属担子菌纲，齿菌科、多孔菌目。猴头菇富含蛋白质、各种氨基酸、维生素B1、维生素C、尼克酸等各种营养成分，同时它具有多种生物活性，所以它具有提高免疫力，提高机体耐氧力，提高心血输出和加速血液循环等作用。还具有抗癌、抗衰老、增强免疫力、降低血糖、血脂等功效。其中猴头菇的多糖作为一类重要的生物活性物质，在对一些人类疑难病症的治疗方面已显示出很好的疗效1。经过临床使用表明它无毒副作用，所以一般它又可以用来制药和做一些保健滋补品的生产，是人类良好的健康营养食品。对于猴头菇多糖的这些重要功效人们已经逐渐开始重视，因此对于猴头菇多糖的研究也不断的加

7、深，不断的进步。本文对猴头菇多糖的提取纯化技术以及它的脱蛋白工艺进行探索性试验。1 猴头菇多糖结构和活性1.1 猴头菇多糖的结构经研究直到现在为止，猴头菇里含有十几种多糖，绝大多数报道多糖中都含有葡萄糖、半乳糖和甘露糖，猴头菇也含有这三种多糖，其中以葡萄糖为主5。猴头菇的多糖是最主要的活性部分，而且它是主要的治疗成分，有重要的保健治疗价值。目前的研究结果一致认为多糖的活性部分为-(13)糖苷键连接的主链和-(16)糖苷键连接的支链构成的葡聚糖。1.2 猴头菇多糖的活性猴头菇的多糖是重要的生物活性物质，因为它具有重要的生物学功能，所以猴头菇的多糖受到越来越多的重视，也就促进学者进一步深入研究。猴

8、头菇的多糖有抗肿瘤、提高免疫力、抗突变、抗衰老的作用，而且能够降低血糖活性。猴头菇多糖是一个免疫增强剂，因而可用于抗肿瘤治疗中。猴头菇多糖可促进IL22分泌和IL22受体表达。在体内注入一定剂量的猴头菇多糖，可增强LAK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，并增加IL22诱导的淋巴细胞的增殖。另外不同剂量药物对LAK活性诱导有不同的影响，而且是在一定剂量下才有得作用，这说明猴头菇多糖是一种免疫调节剂。在体内注入一定剂量的猴头菇多糖可增加LAK细胞的活性，提高LAK细胞抗肿瘤疗效，这在LAK细胞临床应用方面非常有意义6。我们都了解自由基能引起细胞衰老与死亡，而众多真菌和中药的多糖研究表明，多糖能增强免疫功能

9、，清除自由基而达到抗衰老的作用。相关研究表明猴头多糖可增加小鼠脑和肝脏中SOD活力，明显降低果蝇和小鼠心肌脂褐质含量，增强果蝇飞翔能力，具有抗衰老、抗疲劳作用。所以猴头菇的多糖对于我们有良好的作用，也将会在我们的生活中占有重要的地位。2 猴头菇多糖的提取生物分离一般包括原料的选取、预处理、细胞破碎、固液分离、初步纯化（分离）、精制（高度纯化）和成品加工等过程2。猴头菇多糖主要可以从它的子实体、菌丝体以及菌丝发酵液中提取。据相关研究表明，猴头菇子实体的多糖提取率和多糖的含量比菌丝体要多8。它的提取方法也有很多种，如热水提取、碱提取、酸提取和盐提取等方法。一般猴头菇的提取多采取热水提取的方法，因为

10、在酸、碱法的提取过程中，容易使多糖发生糖苷键的断裂，而且部分多糖会发生水解而造成多糖提取量的下降，杂质较多。但这些情况在热水提醇沉法中就比较少3，因此此次实验采取热水浸提方法。21 热水浸提猴头菇实验的步骤和方法2.1.1 材料和设备干猴头菇子实体（鲜猴头菇剪去菌柄，放于烤筛上，用40-50温度烘至六、七成干，再升温到60，烘烤至含水量12%以下就可以了）11、胰蛋白酶: (酶活:2500U/g)、碘液、糖化酶，乙醇、硫酸、葡萄糖等。离心机，紫外可见分光光度，电子天平，烧杯等。2.1.2 实验的原理利用葡萄糖标准曲线，根据单因素的实验方法，改变水的倍数、提取的时间和乙醇的浓度，从实验结果得出提

11、取猴头菇多糖的最优工艺。2.1.3 热水浸提操作步骤2.1.3.1 称取6.0g猴头菇倒入圆底烧瓶中，加入表一中对应的蒸馏水的倍数摇匀，置于恒温水浴锅内，按表二中对应的时间浸提。浸提后将混合物进行抽滤，将滤液放入旋转蒸发仪中蒸馏浓缩至20mL左右。浓缩液转入小锥形瓶中，加入下表三中对应浓度的乙醇(20倍于浓缩液)进行醇析24 h使其完全沉淀。再将混合物以3500r/min的转速离心得多糖粗品。2.1.3.2 多糖粗品转入小烧杯并加蒸馏水20mL使其溶解在90下水浴30min将多糖糊化，降温至60，用糖化酶0.005g处理10min，用碘液检验至碘液不变色10。2.1.3.3 称取0.0012g

12、胰蛋白酶，在常温下处理50min，在280nm下紫外检测无明显吸收峰，说明蛋白质已经除尽。2.1.3.4 把透析袋放入大烧杯中煮沸10min，待其完全分离后捞出待用。将处理液装入已用线绑好一端的透析袋，然后在离液面23cm处绑好另一端并进行流动透。透析24h，直至透析袋中的溶液从淡黄色变为无色。2.1.3.5 在透析后的多糖溶液中加入40mL无水乙醇放置24h沉淀。将沉淀后的混合物离心，沉淀转入小烧杯中(记录烧杯的重量)，在40下真空干燥。完全干燥后再次称重，前后的质量差即为提取的粗多糖的量。2.1.3.6 猴头菇的多糖根据加水倍数、浸提时间和乙醇浓度的不同提取量也不同：表1 浸提时间和乙醇浓

13、度相同情况下，加水倍数对多糖提取量的影响瓶号1234加水的倍数5101520浸提时间h2222乙醇浓度%100100100100表2 加水倍数和乙醇浓度相同情况下，浸提时间对多糖提取量的影响瓶号abcd加水的倍数20202020浸提时间h2468乙醇浓度%100100100100表3 加水倍数和浸提时间相同情况下，乙醇浓度对多糖提取量的影响瓶号ABCD加水的倍数20202020浸提时间h2222乙醇浓度%708090100从以上三个表中可以看出：加水倍数从5倍体积到15倍体积水的过程中，猴头菇多糖提取率有明显的提高。从15倍体积到20倍体积水的过程中，多糖提取率的提高虽然没有前面的明显，但是也

14、有较大提高；浸提时间从2h到6h，提取率有明显的提高，6h后提取率变化很微小；乙醇的浓度从60%90%中猴头菇的多糖提取率都有明显的增长，但90%以后趋势变得比较平缓，说明90%的乙醇浓度已经能够把多糖完全沉淀下来。根据以上结果表明猴头菇子实体的多糖提取的最优条件分别为:浸提6h，加水20倍，90%浓度的乙醇。据相关研究表明，在热水抽提的过程中加入一定量的Nacl、Na2CO3等均可以提高多糖的所得量9。3 猴头菇多糖的分离纯化猴头菇提取的多糖多为粗多糖，要想它发挥重要作用还需要进一步的纯化。猴头菌属真菌多糖的分离纯化，它的过程包括分离、纯化和纯度鉴定这几个关键步骤。它的粗提物中混有蛋白质、低

15、聚糖、色素等杂质需要除去。低聚糖等小分子杂质可通过透析法除去，除色素一般采用活性炭或DEAE纤维素法脱色5。其中除蛋白是关键的一步，主要有sevag法和TCA法除蛋白等。一般实验室多采取sevag法除蛋白，这种方法是经典的脱蛋白方法。3.1 sevag法除蛋白的方法步骤步骤：配制质量浓度为1%的粗多糖溶液，向粗多糖溶液中加入该溶液1/4体积的sevag试剂(V氯仿V正丁醇=41)，振摇20min后静置30min,然后离心除去沉淀，测定上清液中多糖和蛋白质的含量(以浓度计)。上清液重复以上脱蛋白步骤，直至离心无沉淀产生，如表4。表4 sevag法脱蛋白的实验数据次数12345蛋白脱除率11%14

16、.5%18.5%9%5%多糖损失率4.3%3.7%4.1%4.5%3.9%实验结果表明随着sevag法脱蛋白次数的增加，糖液中蛋白质总的脱除率逐渐增加，但经过3次脱蛋白处理之后增加趋势越来越弱。再进行了5次脱蛋白处理后，蛋白质总的脱除率为58%。随着脱蛋白质次数的增加，糖液中多糖的损失也不断的增加，5次脱蛋白处理后糖液中多糖损失率达20.5%。因此虽然sevag法是常用方法，但此方法中有机溶剂消耗大，费时而且蛋白的脱除率低，并且多次脱蛋白容易造成多糖的损失变大，所以sevag法对于猴头菇多糖脱蛋白的效果并不理想。TCA法脱蛋白时的反应比较剧烈，猴头菇多糖的脱蛋白受TCA浓度的影响。当TCA法的

17、浓度过高时会引起多糖结构的破坏，产生不好的结果。而当TCA的用量为0.1%时，只需要一次脱蛋白就可以把蛋白去除80%以上了。所以只要把握好TCA的浓度就可以有效的去除蛋白了。还有一种需要蛋白酶的除蛋白的方法，不过此方法多不被采用，因为蛋白酶水解除蛋白时蛋白对酶有较高的专一性要求，而找到完全适合的蛋白酶比较困难4。虽然三种方法都不理想，但我们可以根据自己的需要和现存的条件采取不同的方法。4 小结猴头菇多糖的提取方法具有很多种，但它们存在缺点也很多种。如在酸提取多糖时选用三氯乙酸，这种方法多不被采用，因为它的提取率不高比较浪费。盐提取多糖在氯化钠不同浓度下的效果也不同，当氯化钠的浓度超过最适浓度时

18、多糖的提取量反倒下降，因为有一部分多糖会结合蛋白从而发生盐析现象，所以我们一般也不采用这种方法。根据吴金龙等人的实验，用蒸馏水、叫草酸按溶液、氢氧化钠溶液三种提取剂分别提取猴头粗多糖,并用葱酮比色定搪法测定多糖含量结果表明,氢氧化钠溶液提取的粗多糖量最高,因此它其中的多糖含量也是最高7。从研究了料液比、乙醇浓度、时间对多糖提取率实验结果显示:乙醇浓度和料液比是影响多糖提取率的主要因素，最佳工艺为料液比1: 20,乙醇浓度为95%，浸提时间4h，此时猴头菇多糖提取率为7.29%9。在研究猴头菇的多糖提取方法方面，我们可以尝试新的提取工艺，如超声波辅助萃取、微波辅助萃取、超临界萃取、超滤以及膜分离

19、等。根据张树海的研究表明联合采用热水浸提和超声波处理的方法可以提高猴头菇多糖的提取率。在90 、加水20倍、pH=7.5、浸提8h、超声波处理50s的条件下浸提率最高10。猴头菇的分离纯化方法有很多种，比如离心分离，萃取分离，层析分离，膜分离和沉淀分离等。它们主要是依据离心力、分子大小、浓度差、压力差、吸附作用、亲和作用、疏水作用和溶解度等原理对原料或产物进行分离纯化。不同的分离对象需要不同的分离方法才能有效的被分离2。因为猴头菇多糖内是含有像蛋白质这样的生物大分子物质较多，所以猴头菇的多糖分离纯化主要采用乙醇分级、柱层析等方法。目前多糖分离最广泛利用的方法是超滤法，但对于猴头菇的多糖分离研究

20、中还没人提到用此方法。猴头菇多糖的纯度鉴定方法有比旋度法、超离心法、高压电泳法及凝胶过滤法等，一般我们得需要2种以上的方法才能确定其均一性5。同时多糖的提取率会随着菌种、生长条件、提取的部位、提取工艺的不同而不同。其中子实体的多糖含量是菌丝体的三倍，而且影响多糖含量的因素也有很多3。又因为猴头菇多糖的生产适合工厂化生产，所以在工艺方面我们就得要求更高，尽量减少多糖的损失。而现在猴头菇多糖的研究中存在的主要问题就是传统提取工艺提取率低，耗时久等。因此未来我们的研究就要求要更深入，往更精细得方面发展。参考文献1朱美静，童群义.猴头多糖脱蛋白方法的研究.江南大学食品学院,江苏无锡214036.2005.04.04。2杨昌鹏，张爱华.生物分离纯化.中国农业出版社，2007.6。3樊伟伟，黄惠华.猴头菇多糖研究进展 华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640。食品科学，2008,Vol29No.01355。4于宙、钟洁和吴克.猴头多糖的提取和分析.1)合肥联合大学,合肥