呼吸道合胞病毒感染过程中粘蛋白1的抗炎效应

1、呼吸道合胞病毒感染过程中粘蛋白 1 的抗炎效应呼吸道合胞病毒（RSV）于1957年被鉴定。一直以来，RSV被认为是世界范围 内导致婴幼儿严重呼吸道感染的主要病因。流行病学研究发现,RSV是造成5岁以下儿童由于呼吸道感染入院的主要致 病因素。它可以引起下呼吸道炎症性疾病 , 如病毒性细支气管炎和肺炎 , 特别是在 早产儿以及具有呼吸系统、 心血管系统和免疫系统缺陷的病人 , 甚至是致命性的。RSV首次感染后不能有效地诱导机体免疫系统产生免疫记忆,因此，在人的 一生中,RSV重复感染是经常发生的。不幸的是，经过50年的研究，还没有研制出 有效的治疗方法,也没有成功开发出预防RSV感染的疫苗。RSV

2、属于副粘病毒科中的肺炎病毒属,是一种负单链RNA病毒。其基因组由 15,300 个核苷酸组成 , 共编码 11 种蛋白质。RSV侵入机体后,主要感染呼吸道上皮细胞。呼吸道上皮细胞构成了从鼻腔 到终末细支气管的第一道屏障。是病原体经呼吸道侵入机体后产生炎症反应的主要起始部位。RSV接近呼吸道上皮细胞并进入呼吸道上皮细胞内的过程激活机体的免疫系统。此过程主要是由RSV勺G蛋白和F蛋白与细胞表面的多种蛋白质相互作用所 介导。目前研究发现这些膜蛋白可能是 Toll样受体（TLR）家族中的TLR2 TLR3 TLR4 TLR7或 TLR8中的一种或多种。在哺乳细胞体内发现有12种TLRs TLRs属于I

3、型糖基化膜蛋白。TLRs的N末端位于细胞外，含有1628个富含亮氨酸的重复序列（LRR）。每 个LRR由2030个氨基酸残基编码,含有进化上保守的"LxxLxLxxN"基序。TLRs的C末端位于细胞内,其细胞内段含有Toll样受体/白细胞介素1受体结构域(TIR)。TIR结构域是TLRs细胞内段募集桥接蛋白进而活化下游信号通路所必需。通过对细胞膜上不同的TLRs和其配体所形成复合物的晶体结构解析发现,TLRs与其配体相互作用后,形成同源二聚体,如TLR3-TLR3或异源二聚体,如TLR1-TLR2 TLR4-MD等,即形成马蹄样结构(“m”型结构)。这一结构是TLRs 与其

4、配体相互结合并初始下游信号通路所必需。TLRs可以识别和结合多种来源于病毒、病原性细菌、病原性真菌和单细胞寄生虫等的病原相关分子模式(PAMP物质。RSV与呼吸道上皮细胞表面的TLRs 相互作用后 , 可以诱导其合成并释放多种细胞因子 ,如 IL-6 、 IL-8 、单核巨噬细 胞集落刺激因子(GMCSF、转化生长因子(TGF)和肿瘤坏死因子a (TNF- a )。在这些细胞因子中,TNF- a的作用具有两面性。首先TNF-a在RSV感染早期 有利于机体清除RSV但是过多的TNF-a分泌或长时间的作用也可以带来严重的 肺损伤。这正是有些感染RSV的小儿出现严重的下呼吸道症状,甚至死亡的原因。T

5、NF-a是由纪念Sloan-Kettering 肿瘤研究所的Loyd博士于1975年发现，其 cDNA于 1984年被克隆出来。TNF-a的前体物质是一种212个氨基酸残基编码的U型跨膜蛋白质，以同源 三聚体的形式存在于细胞膜上。这种 TNF-a 的前体物质在 TNF-a 转换酶 (TACE) 的蛋白切割作用下 ,生成可溶性的 TNF-a 。有活性的TNF-a必须以三聚体的形式存在，当TNF-a的浓度过低时，其三聚 体趋于解聚,TNF- a进而失去活性。细胞膜上存在两种 TNF受体(TNFR)。TNFR在绝大多数组织表达,其可以被TNF-a的前体物质和TNF-a三聚体所 激活。而TNFR2仅表

6、达于免疫系统,可以被TNF-a的前体物质三聚体所激活TNFR以三聚体的形式与TNF-a三聚体相互作用,进而传递信号。TNF-a与其 受体相互作用后,TNFR的细胞内段发生构象变化，释放结合在死亡结构域上的抑 制性分子SODD暴露出来的死亡结构域可以和桥接蛋白 TRAD相互作用，并可以 招募下游信号分子,活化三条信号通路：1.活化核因子-k B(NF- k B); 2.活化丝 裂原活化蛋白激酶(MAPK信号通路；3.诱导调亡信号。因此 TNF-a 具有诱导细胞凋亡、诱导炎症、抑制肿瘤生长、抑制病毒复制 的功能。这些功能的基础是TNF-a可以参与调控免疫细胞。同时,实验证实TNF的功能紊乱可以导致

7、多种疾病,甚至是肿瘤。RSV是导致 小儿呼吸道疾病及由此造成的死亡的主要原因。流行病学数据显示，尽管RSV感染在大多数小儿引起上呼吸道感染症状，但 也有 5%的患儿会演变成严重的下呼吸道感染 , 如细支气管炎。仅在美国 , 每年平 均都会有130,000病人因为RSV感染造成的严重下呼吸道疾病入院。不仅如此,在老人和免疫功能不健全的人中 ,特别是接受骨髓移植的患者,RSV感染也会造成极高的病死率。而且，还有证据表明，早年RSV感染会使患 者一生中患哮喘的几率增加。正如我们前边介绍的，TNF-a是造成以上情况的罪魁祸首。不幸的是，目前 还没有研制出有效的预防RSV感染的疫苗，也没有行之有效的治疗

8、药物。但我们注意到，在大多数患者体内,RSV感染还是一种自限性疾病。因此，在 正常人体内必然存在一种负反馈调节机制来抑制 RSV感染后过度释放的TNF-a , 从而阻止由此产生的肺组织损伤。我们前期的实验数据表明,TNF- a可以通过TNFR1-MEK1/2-ERK1-Sp轴诱导 呼吸道上皮细胞表达粘蛋白1(MUC1。而MUC具有抑制炎症的功能。更有意思的是,我们最近的数据表明,MUC1可以通过阻断TLRs信号通路来抑 制病原体造成的TNF-a分泌。由此我们推断在正常机体内可能存在这样一种负 反馈调控机制：RSV通过与呼吸道上皮细胞表面的TLRs相互识别与作用后,诱导 其分泌TNF-a，上调的

9、TNF-a通过TNFR1信号通路促进呼吸道上皮细胞表达 MUC1,MU(可以反过来通过阻断TLRs信号通路抑制过量的TNF-a生成，从而抑制 肺损伤。MUC是粘蛋白家族中的一个成员，是高度糖基化的膜偶联粘蛋白。其主要表 达于上皮组织的管腔面。MUC由细胞外段、跨膜段和细胞内段组成。细胞外段含有由 20个氨基酸残 基组成的串联重复序列(VNTR),其数目因人而异，从20120个不等，还含有SEA 结构域, 是金属蛋白酶切割的部位。MUC细胞内段含有多种基序,可以和磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)和生长因子 结合蛋白2(Grb2)等多种蛋白质相互作用。这预示 MUC可以参与到多条细胞信 号转导过程中

10、。同时,MUC1在上皮细胞管腔面可以与多种病原体结合,起到保护呼吸道和消 化道等不受病原体感染的作用。为了证实 MUC在RSV感染后确实具有抑制炎症 的负反馈调节功能 ,我们设计了以下实验。实验分三个部分：第一部分即验证RSV感染是否可以诱导呼吸道上皮细胞分 泌TNF-a和上调表达MUC。给予呼吸道上皮细胞系 A549细胞不同浓度的 RSV(MOI=0.1.0.5.0) 刺激。细胞感染RSV 24 h后,分别收集细胞培养上清和细胞总 RNA运用酶联免疫 吸附试验（ELISA）和实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）,分别检测细胞上清 中的TNF-a水平和 MUC1 mRN水平。结果发现：

11、RSV感染可以诱导呼吸道上皮细胞分泌 TNF-a和上调表达MUC1, 并具有剂量依赖关系。第二部分即 RSV诱导A549细胞表达MUC和分泌TNF-a 的时间关系研究。融合的A549细胞血清饥饿24 h后,给予不同浓度的RSV（MOI=、.0）刺激6、12、24、48、72 h。刺激结束后，收集细胞培养上清用以检测 TNF-a水平，裂解 A549细胞提取总蛋白用以检测 MUC水平。二者均使用ELISA方法检测。实验结果显示：RSV感染A549细胞后,MUC1 表达水平从感染后 12h 开始增高 ,24h 后达到高峰 , 并持续到 48 h,72 h 后开始下 降。细胞培养上清中的TNF-a水平

12、随时间变化曲线与 MUC不同。RSV感染A549 细胞后,上清中的TNF-a水平在RSV感染6 h后即已升高（在感染后更早的时间 即开始升高 , 未列出数据。）,24 h达到峰值,48 h后有所下降。通过分析两者的时间关系我们发现,RSV 感染诱导A549细胞分泌TNF-a早于MUC表达上调,当RSV诱导的MUC表达维 持在峰值期间 ,TNF-a 分泌反而减少。二者的时间变化曲线预示负反馈调控机制的存在。 第三部分即运用可溶性 1 型TNF受体（sTNFR）、过表达及敲除MUC来进一步验证MUC在RSV感染后的负 反馈抑炎机制。sTNFF的引入可以阻断RSV感染所造成的呼吸道上皮细胞 MUC表达上调,这 说明RSV感染造成的呼吸道