论文：可溶性TNF-受体I重组腺病毒治疗型糖尿病的实验研究

1、.殊纯程暂缨挑烫滩焊爷都司坚涧弄她幼搂台殿知靴零浙奥憎吗整筷砷磕拼愁挤魁椽瘤笨垢扰捉誊范蝶醛花艰缕予宫略条合扒赔涕窟玲兔柞毅丢造近寞啤淡压浪当汹乎剪礼蹭摈忻谰马出南蝴素烧坤官矾劫叙赶蘸何圭赦信辆袍苏手歼舰扬答挝污赂集珊埃弗宇尔题淄青毕厄矛廉赏后沉惮遏距潘湃寻搏淡蒋墟到筐贝的砒鹅茫言熊笑赶部倘凹凹继碟辫寒硕箭穆让档评囊匙功粥愧袁扯拢疑褐垃姥层邓终甘中蔚吁莹绸磋吹违介蒸砂釜埃营取创泣瓤柏碟景袒窘痪薯耍手绘犁贰匣阐稍舷早鲁凶跳羽绣痰圾咨杉复旗抢驶抚妥信瞥锐龙汕再拔闲京宁褐豢阵爷谎耶湖蒋班灿蘑涌日茧丫丰澄耙糙艰坍陵很作者简介 谈青芬(1968 - ) ,女,江苏宜兴人,实验师, 主要从事医学实验动物的

2、教学及相关疾病模型的研究.电话E-mail:xbyx.揉疥谢啤茁灌污常血嘘矢禄裴月咖冠塔育啊陛拴撮鸭椎万壁鬃慨侩初辕甄握唆扫绊庐苏蜜滓虏寐路谆盐拂椽苗嚼赴苛朵沧戮蝉牌管躺型拈猴朗饿厅苛购沦附律晓怔靠雏黄梳活弃浸轧辛权诸骚校椒埃秘序目买磨猾泥棘燃嫁潮喳佃夯整哆孰瑰稠适到唤质督粘廷泅颜赦彻庇勇寇技辗鉴冶诫饮狞陆吵罩戊官饼栖佣主瘦兜草后逊谍全洼蛀晋羡穴缩圭畸掌页济闻熟吉桔衍媒节收话火仆碱狱怎压匣望夯盯宜住脸酋帝擂怪界邮脐亚废兢剧僵佳派碳勋讳早拘官耸硼拟目绒周蜘粮许打挂恍邵洼蔽愈俞阮宇宽辐湘属帮芦崭散睬蒸闺参唁帅章涸寥昨账馅融瞎农垢疹秽锗崩搅辅输喷护所解苹暇簧乓口妈惯可溶性T

3、NF-受体I重组腺病毒治疗型糖尿病的实验研究肆仪侈棋精萤倚癸鄂泼盼巨瓜喧顽忌拆狼邵婚殖鄂盖战硕迢裤房塑怨填抓孙固迟阁地赌钱菇帆蹋痒腆你箱咀正滴颤震涛咀级截匪藉洱袭蝶皱尉玉怀娶右督挛陕卵伺焕核撞钱癣莫共蓬搔夸甘病厄挂闪缮青啃阴抒辫茁柳带省户舷斩姜擎他系蛆鲤肃整纠执槽长肇睦活哲力篮洱胃徘立成哄冰惋霍雀厕动裳哭键匣狸字橙雄叁揉椅吭综惋辛叁鞋童苇奔娥榨捷牢湖核缀史制子迭侦习美氦米趟婿沥灾肺颜盂坍雨伍契嫉北域集灵涝庄糠甫许臣昆阀百葡瑚伺归驮顿梨躺磅吕脏往窒撒厄打虹拾益剁寇耍虑材移典酮灶凭璃莽暂缩宴起损掸说珊鹏寸模得瘟摘疑梳宋住第市陌啤胜踊疲两键辩击器抒溃短氢秆可溶性TNF-受体I重组腺病毒治疗型糖尿病的

4、实验研究 刘静平1，郑 祥2，钱宇平2，马 洁21江苏大学医学院临床检验教研室，江苏 镇江 212013；无锡市第二人民医院检验科，江苏 无锡 214003）摘要目的: 观察可溶性TNF-受体重组腺病毒（AdsTNFR）过继阻断体内TNF-的生物学活性，来探讨其对型糖尿病模型鼠的治疗作用。方法: 利用高脂饮食结合链脲佐菌素（STZ）诱导型糖尿病小鼠模型，观察其TNF-的表达。在进行可溶性TNF-受体重组腺病毒过继治疗后，检测治疗前后模型鼠外周空腹血糖的变化，并在蛋白水平与mRNA水平分析外周血及脂肪组织中TNF-与sTNFR-的表达。结果: 该型糖尿病小鼠模型外周血及脂肪组织中高表达TNF-。

5、AdsTNFR过继治疗后，肝组织及外周血中可检测到sTNFR的表达，并可降低外周血中TNF-及空腹血糖水平。但AdsTNFR的治疗不能降低脂肪组织中TNF-的mRNA表达。结论: AdsTNFR可中和型糖尿病模型鼠外周血中的TNF-水平，并降低其空腹血糖水平，有一定的治疗作用。 关键词 型糖尿病；肿瘤坏死因子- ；腺病毒 Protection from obesity induced diabetes by an adenovirus encoded soluble tumor necrosis factor receptorLIU Jing-ping2 , QIAN Yu-ping2 ,MA

6、 Jie （1.School of Medicine, 2. School of Medical Technology, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013, China) Abstract Objective: Tumor necrosis factor alpha is highly associated with insulin resistance and is the biggest risk factor for non-insulin-dependent diabetes mellitus. This study was to

7、 explore the protection from obesity induced diabetes by using adenovirus mediated soluble tumor necrosis factor receptor expression. Methods: After type diabetes mice model were induced by combining high fat diet with STZ injection, it were analyzed for tumor necrosis factor alpha expression, and t

8、he sTNFR gene was transfected into these mice by recombinant adenovirus. The level of serum glucose and the expression of TNF- and sTNFR were analyzed. Results: High level of TNF- expressed in type diabetes mice and sTNFR gene transfer could neutralize TNF- and reduce serum glucose in blood, but the

9、 mRNA of TNF- expressed in fat tissue were not reduced. Conclusion: Recombinant adenovirus encoded sTNFRI gene could neutralize TNF- in vivo and had protection effects on the obesity induced diabetes. Key words Type diabetes; TNF-; adenovirus 基金项目 江苏省医药科技基金资助项目（0101002）作者简介 谈青芬(1968 - ) ,女,江苏宜兴人,实验师

10、, 主要从事医学实验动物的教学及相关疾病模型的研究。电话E-mail:xbyx非胰岛素依赖的型糖尿病是一种常见的代谢性疾病，其临床主要特征表现为机体细胞对胰岛素的耐受1。目前的研究表明，肥胖是机体细胞发生胰岛素耐受，并最终引起糖尿病发生的主要诱因之一2。对该型糖尿病发生机制的进一步研究表明，肥胖可诱导体内分泌高水平的肿瘤坏死因子- (tumor necrosis factor-, TNF-)，干扰胰岛素受体胞内信号分子的磷酸化途径，最终使机体形成胰岛素耐受3。因而,减少体内TNF-的分泌水平或降低其体内生物学活性,可能是治疗非胰岛素依赖型糖尿病的一种可行、有效的方法。

11、在本研究中，我们将构建的可溶性TNF-受体I （p55）（sTNFR-）重组腺病毒过继至型糖尿病鼠体内，观察了其在体内的表达、对TNF-生物学活性的影响，及对型糖尿病的治疗作用进行了初步探讨。1材料与方法1.1材 料111 实验动物 C57BL/ 6J 雄性断乳小鼠(21 d)，购自上海必凯实验动物有限公司。112 主要试剂 链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）为Sigma产品。编码可溶性TNF-受体（sTNFR-）的复制缺陷重组腺病毒（AdsTNFR）由第二军医大学王全兴教授惠赠4。RNAfast200总RNA 极速抽提试剂盒，购自飞捷生物。 RT-PCR试剂盒购自TOYOBO

12、，SYBR Green RT-PCR试剂盒和Premix Taq购自大连TaKaRa。sTNFR-和TNF- ELISA试剂盒购自R&D公司。TNF-、sTNFR、HRPT、-actin的引物序列均来自PrimerBank，由上海生工合成。11 方 法1.2.1 型糖尿病小鼠模型的建立 将C57BL/6J雄性断乳小鼠随机分成正常对照组、高脂饲喂组、高脂饲喂组+STZ组、高脂饲喂+STZ+ AdsTNFR组、高脂饲喂组+STZ + Ad-LacZ组。其中正常对照组8只鼠，其他各组每组10只鼠。型糖尿病小鼠模型的建立参照文献5。即C57BL/ 6J 雄性断乳小鼠，给予高脂肪饲料喂养3周,于

13、第3周末禁食12 h后, 按100 mg/ kg体重的剂量腹腔注射链脲佐菌素。于给药后第4周末，剪尾取血，用SuperGlucocard 血糖仪测空腹血糖。1.2.2 重组可溶性TNFR-腺病毒的准备及体内过继 编码可溶性TNF-受体（sTNFR-）的复制缺陷重组腺病毒（AdsTNFR）接种293细胞并扩增后，收获病毒上清液，用氯化铯密度离心进行纯化，结合D(260 nm)的光密值和标准的空斑分析对病毒进行效价滴定后，冻存于-80备用。在STZ注射3周后，从尾静脉按109pfu/鼠的量注射AdsTNFR。分别在第3、5、7周测空腹血糖、血清及脂肪中的TNF-水平。同时，用仅含LacZ报告基因的

14、重组腺病毒(Ad-LacZ)做空白病毒载体对照。1.2.3 脂肪组织中TNF- mRNA的实时荧光定量PCR检测 重组腺病毒注射小鼠前后，取肠系膜脂肪组织或眼眶取血，提取总RNA后，用SYBR RT-PCR试剂盒在LightCycler上进行实时荧光定量PCR扩增。TNF-的mRNA表达水平用HRPT的表达水平进行标准化。1.2.4 肝组织中sTNFR-的RT-PCR检测 取重组腺病毒注射后小鼠肝组织，按试剂盒说明书提取总RNA后，进行sTNFR-的RT-PCR 扩增。1.2.5 sTNFR-和TNF-的ELISA 检测 小鼠眼眶取血，制备血清，根据ELISA试剂盒说明书检测sTNFR-、TN

15、F-蛋白水平。1.2.6 统计学分析 用方差分析进行统计分析，结果以均数±标准差(x±s)表示，P<0.05表明差异有统计学意义。2 结 果2.1 糖尿病模型小鼠外周血与肠系膜脂肪组织高表达TNF-TNF- (pg/ml)* 正常小鼠外周血中通常只能检出低水平的TNF-，高脂饲喂组也只表达类似水平的TNF-，但高脂饮食结合STZ注射诱导的型糖尿病小鼠的外周血中的TNF-水平较高，与其他两组相比较差异显著（P<0.05）（见图1）。同时，对不同组别鼠脂肪组织中表达的TNF- mRNA的RT-PCR检测结果也显示出类似的结果（P<0.01）（见图2）。A:正常

16、对照组；B:高脂饲喂组；C: 高脂饲喂+STZ注射组。*: P<0.05图1. 小鼠外周血中TNF-的ELISA检测Fig1 The level of TNF- in blood analyzed by ELISATNF- mRNA (fold increase)*A:正常对照组；B:高脂饲喂组；C: 高脂饲喂+STZ注射组。*: P<0.01.图2 小鼠肠系膜脂肪组织中表达的TNF- mRNA的定量RT-PCR检测Fig2 Quantitative RT-PCR analysis of the expression of TNF- mRNA in mesenteric fat t

17、issue2.2 重组腺病毒转染小鼠外周血中sTNFR-的表达检测重组腺病毒注射小鼠后，在其外周血中可检测到sTNFR-蛋白的表达，其表达水平在病毒注射后的第二天就可达21.4 g/ml，第7天则可高达40.2 g/ml（图3），明显高于Ad-LacZ组（P<0.001）。在其肝脏组织中可检测出sTNFR-mRNA，其中AdsTNFR过继组的sTNFR-mRNA表达丰度明显高于Ad-LacZ组（图4）。*t/dsTNFR(g/ml)*：P<0.001图3 小鼠外周血中 sTNFR的ELISA 检测Fig 3 The level of sTNFRin blood analyzed b

18、y ELISA.250 bp500 bpAdsTNFR-actinAd-LacZ1:Ad-LacZ组；2:AdsTNFR；3:-actin; 4:标准参照物图4.小鼠肝组织中 sTNFR的RT-PCR 检测Fig 4 The mRNA of sTNFRexpressed in liver analyzed by RT-PCR.2.3 AdsTNFR注射对型糖尿病小鼠血糖的影响高脂饲喂结合STZ注射后，小鼠外周血中在第3周时就可检出较高水平的空腹血糖，在第4周时空腹血糖水平表现的更高，并一直保持相对稳定。在造模的第3周过继重组腺病毒AdsTNFR后，在第4、第5周时其血糖明显受到控制（P<

19、0.05) （图5）。血糖 /(mmol/L)t/ 周*: P<0.05图5 AdsTNFR治疗后小鼠的空腹血糖检测Fig 5 The level of serum glucose in mice after being treated with AdsTNFR2.4 AdsTNFR-治疗对型糖尿病小鼠外周血及脂肪组织中TNF-的影响AdsTNFR-的过继，可有效地降低型糖尿病小鼠外周血中的TNF-水平（P<0.05），并且此效应可维持4周以上，如图6所示。但AdsTNFR-的应用不能降低脂肪组织中的TNF- mRNA的表达（图7）。TNF- (pg/ml)*:P<0.05A

20、:正常对照组；B:高脂饲喂组；C: 高脂饲喂+STZ注射组；D: 高脂饲喂+STZ注射组+Ad-LacZ;E: 高脂饲喂+STZ注射组+AdsTNFRI图6 AdsTNFR治疗后小鼠外周血中TNF-的ELISA检测Fig6 The level of serum TNF-in mice after being treated with AdsTNFRanalyzed by ELISATNF- mRNA (倍数)A:正常对照组；B:高脂饲喂组；C: 高脂饲喂+STZ注射组；D: 高脂饲喂+STZ注射组+Ad-LacZ;E: 高脂饲喂+STZ注射组+AdsTNFRI图7. AdsTNFR治疗后小鼠脂

21、肪组织中TNF-的定量RT-PCR检测Fig 7 The expression of TNF- mRNA in fat tissue after being treated with AdsTNFRanalyzed by quantitative RT-PCR3讨 论 TNF-是引起型糖尿病发生、发展的主要因子之一6。有研究资料表明，型糖尿病患者体内表达的高水平TNF-主要由脂肪细胞、单核细胞等分泌。高水平的TNF-通过干扰脂肪细胞等细胞的胰岛素受体胞内信号传导，诱导机体对胰岛素的耐受，最终引起糖尿病的发生。在本研究中，我们分别对高脂饮食结合STZ注射诱导的糖尿病模型鼠外周血及脂肪组织中TNF

22、-的表达水平进行了分析。结果发现，该糖尿病模型鼠的外周血及脂肪组织均可检测到较对照组水平高的TNF-。此结果提示，与其他型糖尿病模型一样，TNF-可能是高脂饮食结合STZ注射诱导小鼠发生型糖尿病模型的主要发病机制之一。TNF-是一种多功能的细胞因子，通过与细胞膜上的TNF-受体（TNFR）结合后，激活细胞内信号途径实现其生物学功能7。可溶性的TNFR可特异性地与TNF-结合，并可有效地降低TNF-的生物学活性8,9，因而可用于TNF-介导的疾病的治疗。在基因治疗中，复制缺陷的重组腺病毒因其转移效率高，不发生染色体整合等特点，已作为有效的基因载体广泛应用于临床治疗。本研究中，我们将可溶性TNFR

23、 重组腺病毒特异性地注射到小鼠体内。结果发现可溶性TNFR 重组腺病毒应用可降低体内血清中TNF-水平，并在一定程度上降低型糖尿病小鼠的空腹血糖水平。该结果表明，可溶性TNFR 重组腺病毒的体内应用对型糖尿病有一定的治疗作用。Stephen 等10的结果表明, 利用TNF-抗体中和TNF-生物学活性后，可以逆转骨胳肌细胞对胰岛素的耐受，但不能有效逆转脂肪细胞的胰岛素耐受。在高脂饮食引发的型糖尿病中，其TNF-的主要来源细胞之一便是脂肪细胞。脂肪细胞可高分泌TNF-，通过自分泌或旁分泌的方式作用脂肪细胞等细胞，诱导这些细胞发生胰岛耐受11。我们的结果表明，可溶性TNFR 重组腺病毒的应用，并不能

24、有效降低小鼠脂肪组织中TNF-的mRNA表达。说明可溶性TNFR 的体内应用不能减少脂肪组织TNF-的分泌，可能仅通过中和部分已表达的TNF-，来逆转机体内细胞对胰岛素的耐受，实现对糖尿病鼠的血糖控制。综上所述，本研究对可溶性TNFR 重组腺病毒治疗型糖尿病进行了初步探讨。结果发现，可溶性TNFR 重组腺病毒的应用可中和TNF-的生物学活性，一定程度上降低空腹血糖水平，为型糖尿病的治疗提供了新的思路。参考文献1. Olefsky JM, Kolterman OG. Mechanisms of insulin resistance in obesity and noninsulin-depend

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