2020年高二生物选修一专题五《血红蛋白的提取和分离》知识点测试

1、专题五血红蛋白的提取和分离【知识框架】1 .分离不同种类蛋白质可以利用蛋白质各种特性的差异， 如分子的? 所带电荷的?>和对其他分子的等。凝胶色谱法也称做，是根据 分离蛋白质的有效方法；电泳是指带电粒子在 的作用下发生的过程，许多重要的生物大分子，如、等都具有, 在下，这些基团会带上, 在电场的作用下，这些带电分子会 向着与其所带电荷 的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子的差异以及 、的不同，使带电粒子产生不同的,从而实现样品中各种分子的分离。常用的电泳法有 由泳和也泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率取决于 以及 等因素。在测蛋白质分子量（纯度鉴定）时通常使用 电泳。2 .当

2、相对分子质量不同的蛋白质通过琼脂凝胶层析时，相对分子质量 的蛋 白质容易进入凝胶内部，路程较，移动速度；而相对分子质量大的蛋白 质无法进入凝胶内部，路程较，移动速度，导致相对分子质量小的 流 出，相对分子质量大的 流出，相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。3 .蛋白质的提取和分离一般分为四步： 、粗分离、和。 （1）样品（哺乳动物的血液）处理和粗分离样品处理和粗分离的过程为：一 一一。红细胞的洗涤：目的：去除;方法： 离心。采集血样前，盛血容器中需预先加入 作为,以防止0 米血后应及时分离 和, 分离方法米用（500r/min离心10min）,分离后，去除 层透明的黄色血浆，将层色红细胞倒入

3、烧杯，加入 侪体积的,缓慢搅拌10min,低速短时间离心，如此重复洗涤三次以上，直至表明红细胞已洗涤干净。洗涤红细胞时，洗涤次数过少，无法将全部除去，如果血液样品离心后分层不明显，可能原因是;离心速度过 一 和时间过,会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，得不到 的红细胞，影响后续提取的血红蛋白的。血红蛋白的释放：将已洗涤干净的红细胞倒入烧杯， 加 到原血液的体积，使红细胞搅拌器上充分搅拌 白。分离血红蛋白溶液： 度进行局速离心10 min第1层（最上层）： 第2层（中上层）：第3层（中下层）：第4层（最下层）： 将试管中的液体用再加40%加积的,使 溶解，置于10分钟（加速细胞破裂），红细胞破裂释放

4、出血红蛋将搅拌好的混合液转移到离心管内，以2000r/min的速,离心管中的溶液从上往下分为 4层：的层的沉淀层，色薄层固体的水溶液层，的液体其它杂质的沉淀层_过滤、这去, 这中静置片刻后，分离出下层的。粗分离：即。将装有血红蛋白溶液的透析袋放入pH为7.0的中,透析12h,透析的原理是,透析的目的是。（2）血红蛋白的纯化一一凝胶色谱法（层析）制作色谱柱：柱体是长 40cmi内径1.6cm的玻璃管，柱顶部插入安装了 的橡皮塞，柱底部插入安装了 （带头部）的橡皮塞（橡皮塞上 部切成锅底状凹穴），在橡皮塞中安装移液管时，移液管上部 （必'需/不 能）超过橡皮塞凹穴底面，凹穴上覆盖尼龙网，再

5、用尼龙纱将橡皮塞上部包好插 入柱体的下端，移液管头部作为出口部位，连接细尼龙管，用螺旋夹控制尼龙管 的打开与关闭。装填凝胶色谱柱：商品凝胶使用前直接放在 中膨胀，并用将加入洗脱液的 加热至接近沸腾，这种方法既加速凝胶膨胀，又除去凝胶中可能带有的 和排除凝胶颗粒内的 。因为干的凝胶和用缓冲液（洗脱液）平衡好的凝胶的体积差别 （不大/很大），所以装 柱前需要根据色谱柱的内体积计算。交联葡聚糖凝胶（SephadexG-75 白"G表示凝胶的?及, “75”表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水 go 凝胶装填色谱柱时，色谱柱下端连接的尼龙管应 仔T开/关闭），将配制 好的凝胶悬浮液 （一次

6、性/分多次）缓慢倒入色谱柱内，期间（可 以/不能）轻微抖动色谱柱，使凝胶装填均匀，凝胶色谱柱内不得有 存在，否则会搅乱洗脱液中蛋白质的,降低。 一旦发现凝胶柱内有气泡，必需 。凝胶装填完毕，立即连接盛有 （pH为7.0 ）的洗脱瓶，在50cm高的操作压下充分洗涤平衡，使凝胶装填紧密。样品的加入和洗脱：加样前，打开色谱柱下端的流出口，让色谱柱内凝 胶面上的缓冲液缓慢下降，当缓冲液缓慢下降到 时关闭出口，然后按照下图顺序加样，最后连接装有缓冲液的洗脱瓶进行洗脱， 待红色 蛋白液接近色谱柱底部时，用试管收集流出液，每试管 mL如果凝胶色谱柱装填成功、分离操作正确，能清楚地看到血红蛋白的红色区带 &g

7、t;? 地随着洗脱液缓慢流出，反之，如果凝胶色谱柱的装填不好，红色区带?,分离效果不好。通过凝胶色谱（层析）除去透析后的血红蛋白溶液中的。吸臂口沿管 壁环绕移动， 贴书菅壁扪样(3)纯度鉴定：判断 的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。在鉴定的方法中，使用最多的是。十二烷基硫酸钠(SDS能与各种蛋白质形成“蛋白质一SD双合体”，SDS所带负电荷的量 大大超过蛋白质分子的电荷量，掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异， 电泳时，蛋 白质的迁移速率完全取决于 2蛋白质由点样孔向 极迁移,点样孔在极一端；SDStt使蛋白质发生完全变性，多肽链蛋白质解聚成单条肽链，因此，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定

8、的结果是 的分子量。将纯化的血红蛋白样品与若干已知 分子量的标准蛋白分别加入到电泳装置上槽的点样孔中，电泳后，观察血红蛋白条带与标注蛋白条带的位置， 可确定提 取的蛋白质的分子量。图甲的上、下槽中加入 ,上、下才©之间是比较图乙条带蛋白质的分子量大小：4 .血红蛋白的提取和分离常见试剂及其作用：柠檬酸钠： ; 生理盐水： ;蒸储水：使红细胞 ; 40%勺甲苯溶液： ;磷酸缓冲溶液：维持pH稳定，使血红蛋白的不受破坏。5 .缓冲溶液能够在一定的范围内，能抵制外来 对溶液 的影响，维持基本不变，缓冲溶液通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调缓缓冲剂的 就可以制得 使用的缓冲液。【核心要点

9、】1.凝胶色谱层析法项目蛋白质相对分子质里人相对分子质量小凝胶内部不能进入能进入运动方式垂直向卜垂直向卜和无规则扩散运动经过路程较短较长洗脱次序先流出后流出2.电泳法原理在一定pH下，蛋白质分子的某些基团解离后带上正电或负电。在电场的 作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。由于待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。3 .比较琼脂糖凝胶电泳和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(1)从载体上看，利用琼脂糖凝胶作为载体的是琼脂糖凝胶电泳，利用聚丙 烯酰胺凝胶作为载体的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。(2)从依据上看，利用了分子带电性质差异和分子大小的是琼脂糖凝胶电泳， 仅利用了分子大小的是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。(3)从优点上看，琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需处理， 电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳消除了净电荷对 迁移率的