辣木黄酮和多糖提取方法及其含量影响因素的初步研究

1、辣木黄酮和多糖提取方法及其含量影响因素的初步研究摘要为了稳定和提高辣木产品的有效成分含量，本研究比较了辣木有效成分黄酮和多糖的提取和测定方法，找到了辣木黄酮和多糖提取方法和条件的最佳优化组合。并应用乙醇回流法和苯酚-硫酸法探讨了叶龄、器官、产地、采收期、管理水平、朝向等与有效成分含量的关系。研究结果如下： 辣木总黄酮的最佳提取条件为：用70%的乙醇作为提取溶剂，乙醇用量为20倍，提取温度为80，提取3次，每次90min。在此提取条件下，辣木叶总黄酮量为6.59。 辣木多糖的最佳提取条件为：以15倍的溶剂用量，在90水浴条件下，提取3次，每次120min，在此提取条件下，辣木叶多糖量为25.51

2、。辣木叶片总黄酮和多糖含量均以45d的壮龄叶含量最高，总黄酮含量可达6.11，多糖含量可达21.97；幼龄叶和老龄叶中的总黄酮和多糖含量都比较少。辣木不同器官的总黄酮含量为花柄中最多，根中最少，其变化范围为0.53%-4.47%；不同器官的多糖含量为根中最多.叶柄中最少.其变化范围为8.16%33.61。 不同采收期的辣木有效成分含量均在11月采收时含量最高，其中总黄酮含量为叶5.69、叶柄3.13、茎2.01；多糖含量为叶28.85%、叶柄9.71、茎12.24。 不同管理水平的辣木有效成分含量为：叶在中等管理水平下有效成分含量最高，叶柄和茎中有效成分含量依次为低>中>高。不同朝

3、向的辣木有效成分含量为各器官在向阳和背阳区之间均没有显著性差异。关键词：辣木；总黄酮；多糖；提取方法；发育1引言1.1辣木的概况1.1.1辣木资源的分布 辣木属辣木科(Moringaceoe)、辣木属(MoringaAdans)，为多年生木本植物，是一种有独特经济价值的热带植物。本科仅有1个属。已发现14个种，其M.tenopetala(原产于埃塞俄比亚和肯尼亚北部)、M.percgrina(原产苏丹、埃及和阿拉伯半岛)、M.ovalifera(原产安哥拉和纳米比亚)、M.oleifera(原产于印度北部亚喜马拉雅区域)等4个种已有栽培.主要分布于亚洲的印度、中国、日本，非洲的埃及、肯尼亚、埃

4、塞俄比亚、安哥拉、纳米比亚、苏丹。美洲的墨西哥、美国等30多个热带、亚热带的国家和地区。至今我国已引种栽培Moringa Oleifera(印度传统辣木)、Periyalmlam1(印度改良辣木)和M.stenopetala(非洲辣木)，主要分布于云南、广东、广西、海南、台湾等省区。1.1.2辣木的生物学特征 辣木为多年生深根性落叶植物.乔木，主干直立，最高可达12m；三回羽状复叶，小叶椭圆、短椭圆或卵形，无毛，长1.32.0cm，宽0.30.6cm：圆锥花序，两性花，花白色或乳白色；具芳香气味，花萼盆状；荚果，豆荚长2540cm，每荚有种子20粒左右；种植第二年就能结果，一般每年结果1次(个

5、别地区2次)，每年采集期长达10个月，树龄可达20年。喜光照，在年降雨量5003000mm，气温15以上均能正常生长，最佳生长温度为2535，能耐受轻度霜冻和40以上高温，能适应各种土壤类型，以砂壤土最好，土壤pH值范围在4.8-8.0均能正常生长，适宜在我国热带、南亚热带海拔600 m以下的地区种植，但在墨西哥海拔1200 m以上，津巴布韦海拔超过2000m的地区也能正常生长。1.1.3辣木的营养成分 辣木全株都可利用，营养物质种类多，富含维生素A、B、C、E及钙、钾、铁等矿,质营养元素。据报道其中钙和蛋白质含量分别为牛奶的4倍和2倍，钾是香蕉的3倍，铁是菠菜的3倍，维生素c是柑橘的7倍，维

6、生素A是胡萝h的4倍。此外还含有人体必需的各种氨基酸和微量元素等。其营养价值可与现代营养学家称为“人类营养的微型宝库”的螺旋藻相媲美。1.1.4辣木的开发利用途径(1)高营养的蔬菜 在印度，辣木鲜叶作为蔬菜食用，嫩叶类似菠菜。可以制作成汤或沙拉。嫩果荚也可食用，可以像煮青豆一样烹饪，其适宜采摘期是折断果荚时不出现纤维丝。烹饪种子时，必须先煮几分钟，除去有苦味的种壳，然后把种子仁剥出来就可食用。干种子可以打成粉末。作为调料，有辣味。辣木的花在略微变白之后也可以作为调味料加入色拉中食用。树干上的树脂是一种增稠调味物质，有类似玉米粉的功效。(2)富含植物生长促进因子 从辣木叶片中获得的提取物叶面喷施

7、后能促进植株健康生长，抗病虫害，促进结果、增大果实、丰产等。其活性物质为玉米紊(N-异戊烯腺嘌呤)，属于细胞分裂素类物质。辣木叶汁作为植物生长促进剂，可以使各种作物(洋葱、柿子椒、大豆、玉米、咖啡、茶叶、辣椒，西瓜等)增产25-30。叶面喷洒可以结合其它的施肥、灌溉等活动进行。(3)优质饲料 辣木优良的营养特性，极适宜作为家畜饲料。在尼加拉瓜的试验证明可以达到120t干物质每公顷每年的生物量。辣木作为牲畜饲料即经济又高产，这对小型牲畜饲养业具有特别重要的意义。BIOMASA进行了辣木作为饲料的广泛的实验。用辣木叶饲喂牛(肉牛和奶牛)、猪和禽类。当叶子占饲料的40-50时，奶牛的产奶量和肉牛的日

8、增重量都提高了30；当地的Jersey牛的平均出生重量为22kg，提高了3-5kg。(4)辣木种子油 辣木种子含有丰富的油脂，提取的辣木油黄色鲜亮，含有76的单不饱和脂肪酸，主要是油酸。另外，冷榨的辣木油中还含有天然的抗氧化物质，返使辣木油具有非常稳定，不易腐败的特性。经过脱胶处理的辣木油，其诱导期是油的9-16倍：即使不经脱胶处理，诱导期也是橄榄油的4.4倍。精炼后的辣木油几乎没有任何味道，性质稳定，耐反复煎炸，是一种高级烹调用油。在食品工业中，辣木油可以作为无毒的食品级安全润滑油。(5)安全的净水作用 辣木种子仁里含有大量的低分子水溶性蛋白，部分带有正电荷的聚合电解质，分子量7-17Da。

9、在溶液里呈正电性。当这些蛋白质加入水中的时候.就和使水混浊的负电性微粒(泥沙、黏土、细菌等)结合。在适当地搅拌中，这些微粒体积增长凝成絮状，然后通过重力沉淀或者过滤。因为水中的细菌通常吸附在固体颗粒上。所以用辣木粉末处理过的水，90-99的细菌可以被除去。再通过煮沸、加氯或漂白粉等处理就可以使水安全饮用。辣木种子粉末在净水的同时，也可以在一定程度上降低水的硬度。辣木蛋白质属纯天然无毒的多肽类物质，它主要起一个絮凝剂的作用。优点是净水的效率和pH值无关；添加的剂量也不会影响水的pH值。可以用于有机、无机颗粒的沉淀，诸如水净化处理、植物油的澄清、以及饮料与啤酒中纤维的沉淀处理等。1.1.5辣木的药

10、用价值古印度传统医学认为辣木可以预防和治疗多种疾病，因此被誉为“奇迹之树”。它不但具备不可思议的营养价值，在印度和非洲还是糖尿病、高血压、皮肤病、贫血、关节炎、消化器官肿瘤等传统医学的药材。(1)叶：叶汁具有稳定血压和治疗忧郁的功效：可控制糖尿病人的葡萄糖水平；用叶和嫩芽揉搓太阳穴治疗头痛；用鲜叶制成的泥敷物可治疗腺体增生、溃疡和皮肤感染等疾病；食用叶片可增加母乳量，并有治疗贫血病的功效。(2)花：花汁可治疗溃疡与粘膜炎；其浸提物可做眼药水；花的传统用途是兴奋、利尿和堕胎。(3)根：根用于胃肠气胀排除和轻泻物；根能有效治疗间歇式的发烧，咀嚼食用还能治疗感冒：把根捣碎、加盐制成泥敷物治疗风湿病和

11、关节痛。能有效缓解疼痛；用鲜根、皮和叶制成的混合汁液。滴人鼻孔，可使人从昏迷中清醒；将根咀嚼后，可敷于蛇伤处，防止毒液扩敝。据研究报道，来自根部的一种“Spirchin”物质，可抗苗、止痛、退热、调节血液循环和影响神经系统。在高剂量下，可麻痹迷乱神经；另外，根皮中的“Anthonine”对霍乱菌具有极高的毒性。(4)种子：种子可治疗发烧和腹部肿瘤；种子油可减轻风湿病引起的疼痛，还可用来治疗坏血瘸、虚脱和歇斯底里症。体外试验表明种子水浸物能有效抑制假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，这一研究还显示与新霉素的抑菌效果一样。种子浸液还具有抑制肠部痊挛和利尿的功效。(5)树皮与树脂：树皮可以治疗溃疡

12、和皮肤感染；也可制成开胃物，帮助消化，可以缓解疼痛，滴入耳中治疗耳痛，也可滴人龋齿孔中，去除疼痛。树皮水浸物在低浓度下可增加心脏的收缩率，而在高浓度下可降低收缩率，同时具有降血压的功效。来自树皮的Moringinine对交感神经系统有功效，可作为心脏刺激物，缓解支气管炎。树脂加入芝麻油可治疗头痛，也可滴入耳中治疗耳痛；还可治疗肠道疾病，树脂可治疗发烧、痢疾和气喘；树脂也可用于止血和皮肤发红；树脂还用于治疗梅毒与风湿病。1.2辣木有效成分研究现状1.2.1辣木黄酮研究现状黄酮类化合物(Flavonoid)，又称黄酮体，黄碱素，广泛分布于植物界，是植物的重要次生代谢产物。它们是色原烷或色原酮的衍生

13、物。C6-C3-C6的基本骨架：并根据中间呋喃环的不同氧化水平和两侧A、B环上的各种取代基，分为许多不同的黄酮类型。主要包括：黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、黄烷酮类、查耳酮类、异黄烷酮、双黄酮类等。天然植物中多数黄酮类化合物以苷的形式存在，少数以游离形式存在。黄酮类化合物多为结晶性固体，少数(如黄酮苷类)为无定形粉末.黄酮类化合物的颜色与分子中是否存在交叉共轭体系及助色团(-0H、-OCH3等)的种类、数目以及取代位置有关。以黄酮为例，其色原酮部分原本无色：但在2位上引入苯环后，即形成交叉共轭体系，并通过电子转移、重排，使共轭链延长，因而显现出颜色。一般情况下，黄酮、黄酮醇及其苷类多显灰黄黄色，

14、查耳酮为黄-橙黄色，而二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮类，因不具有交叉共轭体系或共轭链短，故不显色(二氢黄酮及二氢黄酮醇)或显微黄色(异黄酮)。黄酮类化合物豹溶解度因结构及存在状态(苷和苷元、单糖苷、双糖苷或三糖苷)不同而有很大差异。一般游离苷元难溶或不溶于水。易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醇等有机溶剂及稀碱水溶液中。其中黄酮、黄酮醇、查耳酮等平面性强的分子，因分子与分子间排列紧密，分子间引力较大，故更难溶于水。黄酮类化合物广泛存在于植物的各个部位，尤其是花、叶部位，主要存在于芸香科、厝形科、豆科、伞形科、银杏科与菊科中。许多研究已表明不同的黄酮类化合物具有不同的生物活性。除利用其抗菌、消炎、抗突

15、变、降压、清热解毒、镇静、利尿等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪酶等方面也有显著效果。它是大多数氧自由基的清除剂。因而能升高SOD(过氧化物歧化酶)的活力，减少MDA(脂质过氧化物丙二醛)及OX-LDL(氧化低密度脂蛋白)的生成。它可以增加冠脉流量，对实验性心肌梗塞有对抗作用：对急性心肌缺血有保护作用；对治疗冠心病、心绞痛、高血压等有显著效果；对降低舒张压，防治心律失常、心血管病和活血化瘀也起重要作用。目前发现的黄酮类化合物己达5000多种，但研究亦发现，在这众多的黄酮类化合物中却因其结构的不同。有的表现出生物活性，有的却没有生物活性，而且生物活性亦因其结构的差异而不同。所以提取分离出具

16、有较高生物活性的黄酮类化合物对医药及食品工业是十分重要的。从植物中提取黄酮类在医疗方面应用广泛，具有增加冠脉、脑血管流量。抗心肌缺氧、缺血、抗心率失常、软化血管、降低血清胆固醇、抑制血小板凝聚、抗溃疡、抗肿瘤、抗炎、抗过敏、清楚体内自由基、抗衰老增强免疫力的作用。由于黄酮类化合物的这些生物活性使它的研究进入了一个新的阶段，掀起了黄酮类化合物研究、开发利用热潮，促使其在化妆品、医药、食品等工业中有广泛的应用。黄酮类化合物可以直接从食物中获得，如大豆、橙、洋葱。也可以从富含黄酮化合物的植物中提取。作为食品添加剂制成各种保健食品。辣木作为一种功能性植物，有着广阔的开发前景。目前对于辣木其他方面的营养

17、物质已有不少的报道，而辣木总黄酮为辣木中重要的有效成分之一，对辣木总黄酮的组分、功能和叶龄、器官、产地、采收期、管理水平、朝向等研究未见报道，目前国内只有张涛等人采用超声波提取法。陈瑞娇、彭珊珊等采用乙醇回流法测定辣木叶中总黄酮含量的报道，测定结果分别是5.31和3.95。1.2.2多糖研究现状多糖指多个单糖基以糖苷键相连而形成的多聚物。有些多糖的长链是线形，另一些多糖含有支链。各种多糖的差别在于所含单糖单位的性质、链的长度和分支的程度。多糖又称聚糖，可以分为两类。只含有一种单糖单位的多糖，如淀粉叫做同多糖；含有两种或更多种单糖单位的多糖叫做杂多糖，如透明质酸。多糖一般没有精确的分子量，其中的

18、单糖单位可因细胞的代谢需要增加或减少。多糖在自然界分布很广，其功能是多种多样的。有些多糖是单糖的贮存形式；许多多糖是单细胞微生物、高等植物细胞壁和动物细胞外部表面的结构单元；另一些多糖是脊椎动物结缔组织和节肢动物外骨骼的组分。结构多糖有保护、支撑的作用。最重要的贮存多糖是淀粉和糖原。糖类物质是生命代谢中最重要的成分之一.尽管人们在19世纪就已认识到它的重要性。但由于其结构的复杂性和研究手段的局限性，使糖的研究远滞后于蛋白质和核酸。在20世纪60年代，人们就发现多糖复杂的生物活性和功能，可以调节免疫功能，促进蛋白质和核酸的生物合成，调节细胞的生长，提高生物体的免疫力，具有抗肿瘤、抗癌和抗爱滋病(

19、AIDS)等功效。又因多糖毒性极小，所以对多糖类物质的研究将成为继蛋白质和核酸之后的探索生命奥妙的第三里程碑。多糖作为一类重要的生物活性物质。到目前为止，虽然只有云芝多糖、猪苓多糖、香菇糖、茯苓多糖等少数应用于临床，但它们在抗肿瘤、抗凝血、抗突变、降血脂、抗衰老、抗病毒等疑难病症的治疗方面已显示了诱人的前景。近些年来，我国科技工作者在多糖的研究中，特别是真菌多糖和传统的中医药多糖研究中取得可喜的成果。但是，国内多糖的研究一般仅限于分离纯化、化学组成、生物活性和免疫药理研究，糖结构的分析和多糖构效关系研究没有很大突破。而国外，特别是日本学者加强了对中药多糖活性片段(活性决定簇)的化学结构与功能关

20、系的系统研究，并在柴胡、当归多糖研究方面取得了突破性进展。研究认为多糖像蛋白和酶一样可能在多糖分子中存在一个或几个寡糖片断的“活性中心”，并从大量中药多糖一级结构中探索其活性片段。 研究多糖的活性片段及活性片段与多糖之间的关系，不仅有利于研究复杂的多糖结构，且对揭示多糖结构与功能的关系具有重要意义，对阐明多糖在机体内的吸收分布、代谢途径等动态变化以及作用机制都有重要的价值。特别是多糖制品的功效和多糖类药物的质量控制标准的研究都将起到重要促进作用。国际上对糖类的研究日新月异，内容包括糖生物学、糖工程等，并且相继多次召开了有关“糖生物学和糖工程”的专题会议，1995年3月。亚洲分子生物学组织(AM

21、BO)还在日本举办了“糖生物学和糖工程”培训班。目前，日本、美国、及欧盟十分重视糖类的研究，且在糖的研究与开发处于领先地位.并且提出各自的重大科研计划，欧盟在1994一1998年的研究计划中启动了“欧洲糖研究与开发平台”，旨在协调欧洲的糖研究与开发，强化在糖的研究成果转化成商品与美国和日本竞争的能力。值得指出的是我国对于糖的研究尚无重大计划。植物多糖的广泛生物活性已被人们认知。植物多糖药理作用极其广泛，其独特活性和低毒效应在临床应用中具有很大潜力。多糖已越来越受到人们关注。为此有学者预言2l世纪前几十年将是“多糖时代”。多糖作为一种重要生命物质，具有丰富生物活性，且无毒副作用，这有利于我们进一

22、步开发新药，并不断扩展其在保健品、功能性食品中应用，这是多糖区别予其它药物一大优势。但由于多糖本身原因。如多糖结构太复杂，其质量标准不易控制；多糖结构测定及合成有其自身难度和特殊性；有些多糖在天然产物中含量低而不易分离及多糖药理活性与多种因素有关，给多糖研究和临床应用带来很大限制。而我国各种多糖资源丰富，尤其是来源于中草药植物多糖，具有巨大开发潜力。要使更多多糖应用于l临床，造福于人类，这需要广大化学家、食品学家、生物学家及医学家共同努力.接受这一挑战，以显示多糖类化台物广阔应用前景。辣木作为一种功能性植物，有着广阔的开发前景。辣木多糖为辣木中重要的有效成分之一，对辣木多糖的组分、功能和叶龄、

23、器官、产地、采收期、管理水平、朝向等研究未见报道。目前国内只有张涛等、陈瑞娇采用苯酚一硫酸分光光度法，陈瑞娇、彭珊珊等采用葸酮一硫酸比色法测定辣木叶中多糖含量的报道，测定结果分别是15.36、15.86和4.85。1.3本研究目的和意义近年来我国广东、云南、海南、福建等地纷纷引种种植辣木，对辣木的开发利用研究正在南方各地展开。为了稳定和提高辣木产品的有效成分含量，首先比较了有效成分黄酮和多糖的提取和测定方法并对其进行优化，同时在测定总黄酮的乙醇回流提取法和测定多糖的苯酚-硫酸分光光度法的基础上，对叶龄、器官、产地、采收期、管理水平、朝向等与有效成分含量的关系进行了初步研究。为辣木有效成分的开发

24、和利用建立一种快速、简便、准确的提取方法。为辣木高效生产的栽培技术提供理论依据。2材料与方法2.1实验材料2.1.1材料种植与处理辣木于2000年4月28日播种，经过整枝，修剪，土壤肥力控制等各种管理后，经鉴定生长情况良好，采样时间为2007年7-11月。试验材料的处理是先将各种经试验设计的新鲜样品采回后，洗净，然后于105杀青5min，80烘至恒重，粉碎，得到供试辣木粉。2.1.2试验设计与取样2.1.2.1辣木不同叶龄试验设计与取样随机选定60株为试验样本，在样本树上分别用三种颜色的彩带标记.在每一试验样本上叶芽第一出叶柄伸长到约1.03.0 cm时为标准进行标记，每次每株随机选取25个叶

25、总计120片叶以上，标记当天叶龄为l天.共标记三次。三次标记在15、30、45、60天时分别进行采样，每个处理每次随机采摘30片标记叶，共采摘6次，形成三次重复。2.1.2.2辣木不同器官的试验设计与取样在辣木种植区内随机选择30株辣木树为试验样本.在样本树上用彩带做标记。标记当天为第1天，标记在45天时分别进行采样.每次在样本树上随机采摘叶片、叶柄、茎、花、花柄、果、果荚、根各30个。并选择同时期用于播种的种子作为供试样本。2.1.2.4辣木不同采收期的试验设计与取样在辣木种植区内随机选择30株辣木树为试验样本，在样本树上用彩带做标记。从7月29日开始采收第一次，以后每30天采收一次，一直到

26、11月26日，共采收5次。每次在样本树上随机采摘45天的样品各30个作为供试样本。2.1.2.5辣木不同管理水平的试验设计与取样本试验以三个种植区的辣木为材料，分别代表三种管理水平：高管理水平为每株辣木施有机肥20kg、中等管理水平为没施肥，但在该种植地上种了两季的花生，低管理水平为没施肥也没种过其他作物。分别在这三个种植区内随机选择30株辣木树为试验样本，在样本树上用彩带做标记。从7月29日开始采收第一次，以后每30天采收一次，一直到11月26日，共采收5次.每次在样本树上随机采摘45天的样品各30个作为供试样本。2.1.2.6辣木不同朝向的试验设计与取样设向阳、背阳两个处理，以树冠南北等分

27、线为界.线南为向阳，线北为背阳。随机选定30株辣木树为试验样本。在样本树上划分方位，分别用两种颜色的彩带标记在每一试验样本上叶芽第一出叶柄伸长到约1.03.0cm时为标准进行标记t标记当天叶龄为1天。共标记三次。标记在45天时分别进行采样，每个处理每次随机采摘30片标记叶，共采摘3次，形成三次重复.2.2实验药品与主要仪器设备本试验使用的药品亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、浓盐酸、镁粉、硫酸铵、醋酸铅、三氯化铁、浓硫酸、无水乙醇、甲醇、丙酮、苯酚、石油醚等均为国产分析纯；芦丁标准品、葡萄糖标准品为分析纯。本试验使用的仪器设备有HHSll2型电热恒温水浴锅(江苏东台市电器厂)；RE-52AA型旋转蒸

28、发器(上海雅荣生化设备仪器有限公司);SHD一型循环水式多用真空泵(保定高新区阳光科教仪器厂);TDL-5000B型低速冷冻夺冠离心机(上海安亭科学仪器厂)；飞穗牌JFSD-100G干样粉碎机(上海嘉定粮油仪器有限公司)：Ultrospec 2000紫外分光光度计(瑞士Amersham Pharmacia Biotech公司)等。2.3实验方法2.3.1辣木总黄酮的提取及含量测定2.3.1.1辣木总黄酮不同提取方法的比较分别采用水提取法、有机溶剂回流提取法、有机溶剂离心提取法、超声波提取法和分级沉淀法。对辣木中总黄酮量进行测定、选出适合辣木总黄酮提取的最佳方法。2.3.1.2辣木总黄酮的提取准

29、确称取干燥的辣木粉5g，置回流提取器中，加入一定比例的乙醇在一定温度下回流提取，提取液合并，用旋转蒸发器减压浓缩(温度为60-70，浓缩液用石油醚萃取2-3次，脱脂、脱色，下层溶液置100ml容量瓶中，分别加对应浓度的乙醇至刻度，摇匀。从上述提取液中准确吸取5ml，置于25ml容量瓶中，分别用对应浓度的乙醇定容至刻度，即得样品溶液，备用。2.3.1.3辣木总黄酮的定性鉴别为了充分证实提取物是黄酮类化台物.参照王新风等人的方法进行了定性实验。具体方法是分别取提取液2ml置3支洁净干燥试管中：1)加入少许镁粉、浓盐酸显紫红色；2)加5醋酸铅溶液产生黄色沉淀；3)加5三氯化铁溶液显蓝绿色。2.3.1

30、.4芦丁标准曲线的绘制准确称取芦丁标准品0.02g，置100ml容量瓶中，加入60%乙醇至刻度，摇匀，得质量浓度为0.2mgml的标准溶液。准确吸取芦丁标准液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml。分别置于10ml刻度试管中，各加30%乙醇至5ml，再分别加入质量分数为5的NaNO2溶液0.5ml，摇匀。室温放置6 min，再加质量分数为10的Al(N，溶液0.5tul.摇匀。室温放置6 min。再加质量分数为4的NaOH溶液4ml，摇匀，室温放置1015 min。在510nm波长下测定吸光度，同时以试剂空白作参比。2.3.1.5辣木总黄酮的测定 准确吸取样品液1.0ml。分别置

31、于10ml刻度试管中，平行三管，分别加对应浓度的乙醇至5ml，余下部分按标准曲线绘制项所述的方法操作得样品供试液。同时，准确吸取样品液1.0ml，置于10m1刻度试管中，分别加对应浓度的乙醇至5.0ml，再加蒸馏水1.0ml和质量分数为4的NaOH溶液4.0ml作为参比，在510hm波长下测定吸光度值，并按回归方程计算样品溶液中总黄酮含量。2.3.1.6芦丁标准品稳定性试验取供试液，每隔一定时间测定吸光度值，观察其结果在显色一定时间内吸光度值有无变化。2.3.1.7辣木总黄酮提取条件设计在方法比较的基础上选择乙醇、甲醇、丙酮等提取溶剂对辣木中总黄酮量进行测定、选择出最适宜的提取溶剂。在此研究的

32、基础上，分别研究不同溶剂浓度(50、60、70、8吣、90)：不同乙醇用量(6倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍)；不同提取温度(50、60、70、80、90)：不同提取时间(30min、60min、90min、120min、150min、180min)：不同提取次数(1次、2次、3次、4次、5次)等单因素对辣木中总黄酮量的影响。考虑到上述各因素之间的互作效应，在单因素试验的基础上，采用四因素三水平L9(34)进行正交试验，以确定最佳提取条件组合。正交试验因素水平见表l。表1黄酮正交实验因素水平表水平ABCD提取温度/溶剂用量/倍提取时间/min提取次数1601590127020120

33、23802515032.3.2辣木多糖的提取及含量测定2.3.2.1辣木多糖不同提取方法的比较 分别采用水提法、回流法、酸提法、常规法和超声法对辣木中多糖量进行测定、选出适合辣木多糖提取的方法。2.3.2.2辣木多糖的提取与精制 准确称取辣木干样5g，用10倍量的石油醚80回流两小时，提取两次过滤取滤渣10倍量的80%乙醇80回流两小时除去单糖、多聚糖过滤取滤渣加入一定比例的蒸馏水在一定温度下回流提取，冷却真空抽滤取沉淀重复上一步骤2次合并上清液60-65旋转蒸发浓缩把浓缩液用Sevag法去蛋白：上清液置于一般分液漏斗中，按l：l加入Sevage溶剂(氯仿：正丁醇=4:1)，剧烈摇动20min

34、，使其充分混匀，静置30min，离心(10000rmin，10min)，弃去蛋白质和氯仿层，上层水溶液按此法反复去蛋白，直至上清液中无明显的蛋白质出现为止。将透明的上清液定容至250ml，获得多糖待测液，用于测定吸光度值。 测完吸光值后的剩余待测液H2O2脱色(用氨水调pH为8.0左右，加0.4倍于多糖液体积的H2O2，40水浴保温4h脱色。) 60-6512旋转蒸发浓缩加入4倍体积的无水乙醇4沉淀过夜离心(8000rpm，10min) 沉淀物用80%乙醇、丙醇、石油醚依次洗涤室温真空干燥得多糖粗品。2.3.2.3葡萄糖标准曲线的绘制 准确称取葡萄糖标准品21mg，蒸馏水溶解后，定容至100

35、ml，得到0.21mgml的葡萄糖母液。准确吸取此溶液1、2、3、4、5ml，分别置于10ml具塞试管中，并用蒸馏水定容，准确吸取各浓度溶液2m1分别置于10ml具塞试管中，每管加入5苯酚溶液1.5ml(取苯酚100g，加铝片0.1g和NaHCO,0.05g，蒸馏收集182馏分。称取7.5g，加水150ml溶解，置棕色瓶内放冰箱内备用)。再垂直快速加入浓硫酸6.0ml，井用蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置5min，沸水加热15min.之后用流水速冷至室温，用分光光度计于490nm处测定吸光值，同时以试剂空白作参比。以最小二乘法作线形回归方程，得葡萄糖质量浓度c(mgml)与吸光度月的关系为：A=5

36、4.061c+0.0145，R2=0.9993。在0.0043-0.0209mgml范围内，吸光度与浓度线形关系良好。2.3.2.4辣木多糖的测定 准确吸取多糖待测液2.0ml于10ml容量瓶中，定容，作供试液；精密吸取供试液1.0ml，按标准曲线的制各项下自加入“苯酚试剂1.5ml”起，于490nm处测定吸收度。从回归方程求出供试液中葡萄糖含量，按下式计算多糖含量：多糖含量W%=100c.D.f/m，其中c为供试液的葡萄糖浓度(mgm1)，D为供试液的稀释因素，f为换算因素，m为供试品重量(mg)。2.3.2.5多糖换算因子的测定 精密称取上述制得的试样多糖租品0.02g于100ml容量瓶中

37、，用蒸馏水定容。取按标准曲线方法操作，根据回归方程计算多糖中葡萄糖的浓度，按下式计算出换算因子f，f=WC*D，其中w为多糖质量(mg)，C为葡萄糖浓度(mgm1)，D为稀释因素。2.3.2.6葡萄糖标准品稳定性试验 取供试液，每隔一定时间测定吸光度值，观察其结果在显色一定时间内吸光度值有无变化。2 3 2.7辣木多糖提取条件设计 蒸馏水为提取溶剂，分别研究不同溶剂用量(10倍、15倍、20倍、25倍、30倍)：不周提取温度(60、70、80、90、100)；不同提取时间(60min、90min、120min、150min、180min)；不同提取次数(1次、2次、3次、4次、5次)等单因素对

38、辣木中多糖量的影响。 考虑到上述各因素之间的互作效应，在单因素试验的基础上.采用四因素三水平L9(34)进行正交试验，以确定最佳提取条件组合.正交试验因素水平见表1。表2多糖正交实验因素水平表水平ABCD提取温度/溶剂用量/倍提取时间/min提取次数1801590129020120231002515033结果与分析3.1辣木总黄酮影响因素的试验与分析3.1.1提取方法与提取条件对辣木叶总黄酮量的影响3.1.1.1不同提取方法的比较表3多糖正交实验因素水平表提取方法黄酮总量/%显著性123平均值标准差F0.06F0.04回流法5.455.475.395.434.067E-02aA水提法5.455

39、.455.445.448.021E-03aA超声法4.784.474.734.752.571E-02bB离心法4.034.024.044.036.000E-03cC分级法4.024.034.014.027.024E-03cC采用水提取、有机溶剂回流提取、有机溶剂离心提取、超声波提取和分级沉淀提取等五种方法对辣木叶粉中总黄酮进行了提取，提取效果如表3所示。五种方法都能从辣木中提出黄酮。但在不同的提取方法下辣木叶总黄酮量不同，范围在4.0185.435之间，总黄酮量较高的是回流法和水提法，超声法次之，总黄酮量量较低的是离心法和分级沉淀法。其中回流法和水提法差异不显著，但显著高于其他三种方法.离心法

40、和分级沉淀法差异不显著。3.1.1.2芦丁标准曲线制作及稳定性试验 本研究以最小二乘法作线形回归方程，得芦丁质量浓度C(mgm1)与吸光度A的关系为：A=9.2832C-0.0034，相关系数r=0.9999.在0.019-0.090 mgml范围内。吸光度与浓度线形关系良好.准确吸取芦丁标准溶液1.0ml，分置于10ml容量瓶中，各加乙醇至5ml；余下步骤按2.3.1.4芦丁标准曲线的制作方法操作，测定结果见图l。试验表明，在室温25的环境中，显色时问在1570min范围内，吸光度没有变化。80min以后开始下降。因此，在本试验选择的测定时间内，黄酮类化合物与铝离子生成的络合物显色是稳定的。

41、图1 芦丁标准品稳定性3.1.1.3不同提取溶剂对辣木叶总黄酮量的影响表4 不同溶剂回流的辣木叶总黄酮量溶剂黄酮总量/%显著性123平均值标准差F0.06F0.04乙醇5.455.475.395.434.067E-02aA甲醇5.445.415.425.421.358E-02aA丙酮4.794.804.794.796.506E-03bB根据3.1.1.1方法的比较。回流法提取的辣木叶总黄酮量最高，在此基础上其他条件一致，选用三种不同的溶剂对辣木叶干粉中黄酮进行了回流提取，结果如表4。从表中可以看出。回流法的提取溶剂以乙醇最好，甲醇次之，丙酮最差。差异性分析表明用乙醇做溶剂和用丙酮傲溶剂有显著性

42、差异.而乙醇溶剂和甲醇溶剂之间则没有显著性差异。但从经济、安全方面考虑，用乙醇作溶剂更为实用。 综合以上结果可知。用水提法、甲醇回流法和乙醇回流法均对辣木总黄酮具有较高的提取率。从经济、安全、实用方面考虑，乙醇回流法是最适合辣木总黄酮的提取方法。3.1.1.4乙醇浓度对辣木叶总黄酮量的影响其他条件相同的时候，分别以不同浓度的乙醇溶液回流提取黄酮。从图2可以看出：乙醇浓度在60%80%的范围内辣木叶总黄酮量较高，其中以70的乙醇提取效果最好，总黄酮量可达到6.27；乙醇浓度高于80提取效果显著降低，从6.11下降到4.71。这是由于乙醇浓度过高，使黄酮类化合物的溶解度下降，而脂溶性物质的溶出量增

43、加，从而导致黄酮类化舍物的浸出率下降。图2 不同乙醇浓度下提取的辣木叶总黄酮量条件：5g，70，乙醇用量20倍，回流3次，每次120min3.1.1.5乙醇用量对辣木叶总黄酮量的影响 如图3所示，随乙醇用量的增加，辣木叶总黄酮量呈梯度变化。其中乙醇用量由10倍上升到20倍时，黄酮类物质浸出率上升比较快，由5.40上升到6.27.总黄酮量达到最大；乙醇用量在20倍以后。辣木叶总黄酮有所下降，但在乙醇用量为25倍时。总黄酮量变化不明显。乙醇用量越大，浓度梯度越大，物质溶出越多，但是当达到平街后再增大溶剂量.浸出物的变化就不明显了，所以20倍的乙醇用量是一个平衡点。图4不同条件下提取的辣木叶总黄酮量

44、条件：5g，70%乙醇20倍，回流3次，每次120min3.1.1.7提取时间对辣木叶总黄酮量的影响其它条件一定时，考察提取时间对提取效果的影响。从图5可以看出：随着提取时间的增加.辣木叶总黄酮量增加，提取时间达到120min时，总黄酮量达到最大，当提取时间继续加长时，对总黄酮量的影响不大，表明提取时间达到120min时，有效成分已基本溶出。图5 不同提取时间下提取的辣木叶总黄酮量条件：5g，70，70%乙醇20倍，回流3次3.1.1.8提取次数对辣木叶总黄酮量的影响如图6所示，其他条件一致的情况下.随提取次数的增加，辣木叶总黄酮量呈上升的趋势。当提取次数到4次时，总黄酮量变化不大，说明提取4

45、次以后，有效成分已基本溶出。图6不同提取次数下提取的辣木总黄酮量条件：5g，70,70%乙醇20倍，每次120min3.1.1.9多因素正交试验下的辣木叶总黄酮量 对试验结果进行直观分析(表5)和方差分析(表6)，可以看出，辣木乙醇回流提取时。各个因素对辣木叶总黄酮提取效果影响程度不同，各因素的影响程度依次为提取次数(D)>提取温度(A)>乙醇用量(B)>提取时间(C)。由方差分析结果可知，其中提取次数影响程度最大.提取时间影响程度最小，但均未达到显著水平。各因素的最佳组合水平为A3B2C1D3，即辣木总黄酮的最佳提取条件为：用70%的乙醇作为提取溶荆，提取温度80，乙醇用量

46、20倍，提取时间90min，提取次数3次。在此提取条件下。辣木总黄酮量可达6.59。陈瑞娇对辣木叶总黄酮提取效果的研究结果认为，提取条件的影响程度为提取次数>提取温度>乙醇用量>提取时间，与本文研究结果完全一致。但最佳提取条件为：用70%的乙醇作为提取溶剂，提取温度60X2.乙醇用量20倍。提取时间60min，提取次数3次，在此提取条件下，辣木总黄酮量为3.95。其测定结果与本研究有较大差异。原因可能与测定方法、辣木产地、辣木采集时间、采集部位等因素有关。表5 辣木叶总黄酮提取条件的正交实验结果试验号总黄酮量/%ABCD111115.88212226.30313336.254

47、21236.06522315.89623126.15731326.30832136.59933216.11K118.4318.24318.6317.88K218.1018.7818.4818.75K319.0018.51818.4418.91X16.156.0816.215.96X26.036.266.166.25X36.346.1736.156.30R0.300.180.060.34表6 不同提取条件下辣木叶总黄酮量的方差分析误差来源离差平方和自由度方差方差比F临界值SsfsFA0.13820.0.691.394F0.01=8.65B0.04820.0240.485F0.06=4.46C0.

48、00720.0040.071F0.1=3.11D0.20320.1022.051误差0.40080.0503.1.2生长发育对辣木总黄酮含量的影响3.I.2.1不同叶龄叶片的辣木总黄酮含量 表7的结果表明：随着叶龄的增长，辣木叶片的总黄酮含量呈不规律变化，当叶龄增长到45d时，叶片的总黄酮含量达最高，为6.11；其次为生长15d的幼龄叶和60d的老龄叶，总黄酮含量为5.335.46之间；生长30d的壮龄叶的总黄酮含量最低，只有5.07。45d叶的总黄酮含量与15d叶差异不显著。显著大于30d和60d叶龄叶的总黄酮含量。表7 不同叶龄叶片辣木的总黄酮量含量变化（n=9）叶龄/d总黄酮含量/%F0

49、.06F0.01155.46±0.34abAB305.07±0.46bB456.11±0.93aA605.33±0.98bB注：表中相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著（P<0.01,P<0.05,多重比较采用Duncan）以上结果表明，辣木叶片中的黄酮在幼嫩的叶中就有较高的含量，随着叶片的快速扩展，在叶片的壮龄期略有降低，可能是由于叶片的生长速度快于黄酮的合成速度；当叶面积的扩展变缓时，黄酮的积累量达到了最高值；随着叶片的老化，黄酮含量出现了下降趋势。因此。以提取黄酮食用新鲜蔬菜等为目的辣木叶片的采收应以叶龄45d左右的叶为最佳。3

50、.1.2.2不同器官的辣木总黄酮含量由表8可以看出：辣木全株均含有黄酮.但是不同器官的总黄酮含量差异非常显著，器官间总黄酮含量依次为：花柄>叶>花>叶柄>茎>果>果荚>种子>根，其中花柄中的总黄酮含量最高，可达6.31；其次为叶片，含量为4.47；根中的黄酮含量最少，只有0.53。差异显著性分析表明，除果与果荚、种子与根之间差异不显著外，其他器官问差异均达到了极显著水平。表8不同器官辣木总黄酮含量的变化（n=3）器官总黄酮含量/%F0.06F0.01叶4.47±0.06bB叶柄2.46±0.06dD茎1.55±0.0

51、6eE花3.73±0.04cC花柄6.31±0.09aA果1.35±0.04fF果荚1.28±0.02fF根0.47±0.06gG种子0.53±0.02gG注：表中相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著（P<0.01,P<0.05,多重比较采用Duncan）3.1.3生长环境对辣木总黄酮含量的影响3.1.3.1不同采收期对辣木总黄酮含量的影响 从7到11月，每月采收一次辣木的叶、叶柄和茎，比较同一器官、不同采收期的辣木总黄酮含量。从表10中可以看出，不同器官辣木的总黄酮含量随采收时期的变化规律是一致的。各器官的总黄酮

52、含量都以在儿月采收时为最高，分别为叶5.69、叶柄3.13%、茎2.01；以9月采收时为最低。其中11月采收的辣木叶总黄酮含量与其他4个月采收的差异极显著：7、8、10月采收的辣木叶总黄酮含量间差异不显著；它们都显著高于9月采收的辣木叶总黄酮含量。11月采收的辣木叶柄总黄酮含量显著大于其他几个月，除了8月与9月之间差异显著外，其他各月之问差异均不显著。11月采收的辣木茎总黄酮含量与8月采收的辣木叶柄总黄酮含量差异不显著，但显著大于7、10月采收的辣木叶总黄酮含量，极显著大于9月采收的辣木叶总黄酮含量，因此，该种植地的辣木最佳采收期是11月。表10 不同采收期辣木总黄酮含量的变化（n=12）采收

53、期/月总黄酮含量/%叶叶柄茎74.47±0.61Bb2.35±0.36BCb1.61±0.36Bb84.25±0.59Bb2.44±0.48Bb1.66±0.41ABb93.39±0.32Cc1.99±0.36Cc1.07±0.27Cc104.19±0.51Bb2.39±0.47 BCb1.53±0.43Bb115.69±0.58Aa3.13±0.57Aa2.01±0.63Aa注：表中纵向的大写字母代表同一器官不同采收期总黄酮含量的极显著性，小写

54、字母代表同一器官不同采收期总黄酮含量的显著性；横向的大写字母代表同一采收期不同器官总黄酮含量的极显著性.小写字母代表同一采收期不同器官总黄酮含量的显著性.有相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著(P<0.01.P<0.05.多重比较采用Duncan) 同一采收期不同器官的辣木总黄酮均以叶的含量为最高，极显著高于叶柄和茎的总黄酮含量，叶柄和茎之间总黄酮含量差异也达到了显著水平。分析以上结果认为，不同采收期辣木叶、叶柄和茎中总黄酮含量的差异可能和不同季节辣木的生长速度有关。7、8月份炎热多雨，不利于辣木的生长，叶片的扩展变缓，因此，黄酮的含量较高；进入9月份，气温趋于凉爽，雨水减

55、少，很适于辣木的生长，生长速度快于黄酮的形成速度，使各器官的总黄酮含量都达到了最低水平；到11月份，气温逐渐降低，辣木的生长几乎趋于停顿，此时，黄酮的合成速度快于辣木的生长速度，黄酮的积累量达到了最高。3.1 3.3不同管理水平对辣木总黄酮含量的影响 辣木分施肥(每株20kg有机肥)、不施肥间种固氮植物花生和不施肥无间种等三种管理方式，对三种管理方式下的辣木进行了不同采收期的分器官分析。在同一管理水平下，不同器官的总黄酮含量以叶为最高，叶的总黄酮含量极显著高于叶柄和茎的总黄酮含量，叶柄和茎的总黄酮含量施肥区差异显著，在无施肥区差异不显著。表11不同管理水平下辣木叶总黄酮含量的变化（n=27）器

56、官总黄酮含量/%高中低叶4.20±0.86Aa4.56±1.00Aa4.40±0.94Aa叶柄1.90±0.32Cc2.42±0.50Bb2.78±0.54Aa茎1.12±0.20Bc1.32±0.35Cc1.93±0.50Aa 注：表中纵向的大写一母代表同一管理水平不同器官的总黄酮含量的极显著性，小写字母代表同一管理水早不同器官总黄酮含量的显著性；横向的大写字母代表同一器官不同管理水平的辣木总黄酮含量的极显著性。小写字母代表同一器官不同管理水平的藻术总黄酮含量的显著性，有相同字母表示差异不显著。不同字母表示差异显著(P<0.01多重比较采用Duncan)。图7 不同管理水平下辣木叶总黄酮含量的变化图8 不同管理水平下辣木叶柄总黄酮含量的变化图