细胞生物学研究方法学时学习教案

1、会计学1第一页，共51页。第1页/共50页第二页，共51页。 显微镜显微镜电子显微镜电子显微镜复式显微镜复式显微镜倒置相差显微镜倒置相差显微镜微分干涉显微镜微分干涉显微镜荧光显微镜荧光显微镜激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜 光学显微镜光学显微镜透射电子显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜扫描电子显微镜 研究用显微镜研究用显微镜单式显微镜单式显微镜普通光学显微镜普通光学显微镜扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜第2页/共50页第三页，共51页。对任何显微镜来说，最重要对任何显微镜来说，最重要(zhngyo)的性的性能参数是分辨率，而不是放大倍数。能参数是分辨率，而不是放大倍数。第3页/共50页第四页，共5

2、1页。普通普通(ptng)光镜的最光镜的最大分辨率是大分辨率是0.2m。0.2um0.2um0.2nm0.2nm0.1nm0.1nm第4页/共50页第五页，共51页。1 1、普通、普通(ptng)(ptng)光学光学显微镜显微镜 light microscopelight microscope第5页/共50页第六页，共51页。将透过标本的可见光的光程差变成振幅差，提高将透过标本的可见光的光程差变成振幅差，提高(t go)对比度，构造上的特殊之处：对比度，构造上的特殊之处：环形光阑（环形光阑（condenser annulus）相位板（相位板（annular phase plate）用途：可以观

3、察未经染色的标本和活细胞用途：可以观察未经染色的标本和活细胞第6页/共50页第七页，共51页。F. Zernike于于1935年发明年发明(fmng)并因此并因此获获1953年诺贝尔年诺贝尔物理奖物理奖第7页/共50页第八页，共51页。物镜与照明系统颠倒，前者在物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之载物台之下，后者在载物台之上，可以上，可以(ky)用于观察培养用于观察培养皿中的活细胞。皿中的活细胞。第8页/共50页第九页，共51页。在相差显微镜原理的基础上，利用两组平面偏振光的在相差显微镜原理的基础上，利用两组平面偏振光的干涉，加强影像干涉，加强影像(yn xin)的明暗效果，能

4、显示结构的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。与相差显微镜相比，立体感更强的三维立体投影。与相差显微镜相比，立体感更强第9页/共50页第十页，共51页。为落射式照明，即光源为落射式照明，即光源(gungyun)通过物镜投射于样通过物镜投射于样品品光源光源(gungyun)为波长较短的光，分辨力强为波长较短的光，分辨力强用于观察细胞组分特异发出的自然或标记荧光用于观察细胞组分特异发出的自然或标记荧光第10页/共50页第十一页，共51页。兼有明视野、相差、兼有明视野、相差、微分干涉、荧光、显微分干涉、荧光、显微摄影等功能，是高微摄影等功能，是高级级(goj)研究仪器。研究仪器。第11页/共50页第

5、十二页，共51页。第12页/共50页第十三页，共51页。Epi-fluoresceneConfocal荧光荧光(ynggung)显微镜与扫描共焦显微镜的比较（小鼠显微镜与扫描共焦显微镜的比较（小鼠肾小球）肾小球）Alexa Fluor 488 wheat germ agglutinin, a green-fluorescent lectin, was used to label elements of the glomeruli and convoluted tubules. The filamentous actin prevalent in glomeruli and the brush

6、border were stained with red-fluorescent Alexa Fluor 568 phalloidin. The nuclei were counterstained with the blue-fluorescent DNA stain DAPI. Molecular Probes FluoCells prepared slide #3 (F24630)Zeiss Plan-Neofluor 40 x/1.30 OilZeiss C-Apochromat 40 x/1.1 W Corr第13页/共50页第十四页，共51页。荧光观察细胞荧光观察细胞(xbo)结结

7、构构细胞细胞(xbo)内的动态变内的动态变化化FRETFRP第14页/共50页第十五页，共51页。鲁斯卡鲁斯卡(19061988)，德国物理学家，德国物理学家，1932年研制年研制第一台电子显微镜，第一台电子显微镜，1986年获诺贝尔物理奖。年获诺贝尔物理奖。二、电子显微镜技术二、电子显微镜技术(jsh)(jsh) Electron microscopy Electron microscopy第15页/共50页第十六页，共51页。 1 1、光镜与电镜的主要、光镜与电镜的主要(zhyo)(zhyo)区别区别（1）光源）光源(gungyun)不同不同: 可见光可见光/紫外线紫外线-电子束电子束 （

8、2）透镜不同）透镜不同: 玻璃玻璃-电磁透镜电磁透镜 （3）真空）真空 （4）显示记录系统）显示记录系统 （5）分辨率）分辨率: 0.2 um -0.2 nm第16页/共50页第十七页，共51页。1、透射、透射(tu sh)电子显微镜电子显微镜 transmission electron microscope, TEM透射式电子显微镜用于观察透射式电子显微镜用于观察(gunch)小于小于0.2m的细的细微结构，称为亚显微结构（微结构，称为亚显微结构（submicroscopic structures）或超微结构（）或超微结构（ultramicroscopic structures）.Figur

9、e 3-20. Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions. 第17页/共50页第十八页，共51页。超薄切片超薄切片(qi pin)制样技术制样技术 取材取材 固定固定 脱水脱水(tu shu) 渗透、包埋渗透、包埋 超薄切片超薄切片 厚度厚度40-50nm 染色染色电镜的实际分辨率与电镜的实际分辨率与切片切片(qi pin)厚度有厚度有关关第18页/共50页第十九页，共51页。Figure 3-29. Electron micrograph of negativel

10、y stained actin filaments. Each filament is about 8 nm in diameter and is seen, on close inspection, to be composed of a helical chain of globular actin molecules. (Courtesy of Roger Craig.) 第19页/共50页第二十页，共51页。冷冻冷冻(lngdng)蚀刻电镜技术蚀刻电镜技术 Freeze Etching electron microscopy第20页/共50页第二十一页，共51页。20世纪世纪60年代年

11、代(nindi)问世，用来观察标本的表面结构问世，用来观察标本的表面结构目前扫描电镜的分辨力为目前扫描电镜的分辨力为 610 nm。第21页/共50页第二十二页，共51页。Figure 3-23. Scanning electron microscopy. Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A). For comparison, the same structure is shown by differential

12、-interference-contrast light microscopy (B) and by thin-section electron microscopy (C).第22页/共50页第二十三页，共51页。Binnig和和Rohere 1981年发明，年发明，1986年获奖；年获奖；可观察可观察(gunch)到原子级的图到原子级的图像。像。第23页/共50页第二十四页，共51页。A.X-ray crystallographyB. X射线衍射射线衍射(ynsh)B. NMR spectroscopy核磁共振核磁共振(h c n zhn)成像成像第24页/共50页第二十五页，共51页。普

13、通普通(ptng)离心机：转速离心机：转速25000 r/min超速离心机：超速离心机：30000 r/min第25页/共50页第二十六页，共51页。在密度均一的介质中由低速到高速在密度均一的介质中由低速到高速(o s)逐级离心，逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器用于分离不同大小的细胞和细胞器 。细胞器沉降细胞器沉降(chnjing)顺序顺序：核、线粒体、溶酶体与过：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基氧化物酶体、内质网与高基体。体。第26页/共50页第二十七页，共51页。 用介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，用介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，细胞混悬液或匀浆

14、细胞混悬液或匀浆(yn jin)置于介质顶部，通置于介质顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。过离心力场的作用使细胞分层、分离。 常用介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖常用介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖 分为速度沉降（分为速度沉降（velocity sedimentation）和等密度）和等密度沉降（沉降（equilibrium sedimentation） 。第27页/共50页第二十八页，共51页。柱色谱(s p)亲和色谱第28页/共50页第二十九页，共51页。Figure 3-42. SDS polyacrylamide-gel electrophoresis (SDS-PAGE).Figur

15、e 3-44. Separation of protein molecules by isoelectric focusing.Figure 3-45. Two-dimensional polyacrylamide-gel electrophoresis.第29页/共50页第三十页，共51页。二、细胞内核酸、蛋白质、糖等成分的显二、细胞内核酸、蛋白质、糖等成分的显示示(xinsh)(xinsh)方法方法 为了对某些细胞成分进行定性和定位研究，利用为了对某些细胞成分进行定性和定位研究，利用染色剂可与细胞某种成分发生反应而着色的原理染色剂可与细胞某种成分发生反应而着色的原理加以显示，称为组织化学加

16、以显示，称为组织化学(huxu)和细胞化学和细胞化学(huxu)染色方法（染色方法（histochemical and cytochemical staining method）；）； 如：细胞内如：细胞内DNA和和RNA的原位显示的原位显示 第30页/共50页第三十一页，共51页。Myofibrillar ATPase: Identifying Fast and Slow FibersSuccinate Dehydrogenase(琥珀(h p)脱氢酶): Identifying Oxidati ve Potential Promoter:GUS第31页/共50页第三十二页，共51页。 是根

17、据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术合，对抗原进行定位测定的技术(jsh)，常用的，常用的标记物有荧光素和酶标记物有荧光素和酶 免疫荧光法（免疫荧光法（immunofluorescent technique） 酶标免疫法（酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method）二、细胞内特异(ty)蛋白质的定位和定性第32页/共50页第三十三页，共51页。免疫荧光法免疫荧光法酶标免疫酶标免疫(miny)法法第33页/共50页第三十四页，共51页。四、细胞内特异核酸序列的定位(dngwi)和定性原位杂交（i

18、n situ hybridization）人类染色体端粒人类染色体端粒DNADNA的荧的荧光光(ynggung)(ynggung)原位杂交原位杂交照片照片果蝇果蝇HBHB基因表达的原基因表达的原位杂交照片位杂交照片第34页/共50页第三十五页，共51页。 对单个细胞进行对单个细胞进行快速定量分析快速定量分析(dnglingfnx)分选的一门技术；分选的一门技术；第35页/共50页第三十六页，共51页。 活体或在体活体或在体(in vivo ) (in vivo ) 离体或体外离体或体外(in vitro ) (in vitro ) 细胞细胞(xbo)(xbo)培养培养 (cell cultur

19、e) (cell culture) 就是选用最佳生就是选用最佳生存条件对活细胞存条件对活细胞(xbo)(xbo)进行培养和研究的技术；进行培养和研究的技术；第36页/共50页第三十七页，共51页。 原代培养原代培养 (primary culture)：从动物机体取出进：从动物机体取出进行行(jnxng)培养的细胞群。培养的细胞群。 传代培养传代培养 (passage)：将细胞从一个培养瓶转移：将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。 细胞株细胞株 (cell strain) 和细胞系和细胞系(cell line)第37页/共50页第三十

20、八页，共51页。 组织培养组织培养 (tissue culture)：诱发产生愈伤组织，：诱发产生愈伤组织，诱导再分化可培养出再生诱导再分化可培养出再生(zishng)植株植株 单倍体培养单倍体培养(haploid culture )：花药或花粉培养：花药或花粉培养获得单倍体植株，人为加倍后可得到完全纯合的获得单倍体植株，人为加倍后可得到完全纯合的个体个体 原生质体培养原生质体培养(protoplast culture)：第38页/共50页第三十九页，共51页。 两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合过程称为细胞融合 (cell fus

21、ion)或细胞杂交或细胞杂交 (cell hybridization) 基因型相同的细胞融合称为同核体；来自不同基因型相同的细胞融合称为同核体；来自不同基因型的杂交细胞称为异核体；基因型的杂交细胞称为异核体； 诱导方法：生物诱导方法：生物(病毒病毒)、化学、化学(huxu)(PEG)、物理物理(电激、激光电激、激光)。第39页/共50页第四十页，共51页。英国人英国人Kohler和和Milstein 1975年将两种细年将两种细胞杂交而创立了单克隆抗胞杂交而创立了单克隆抗体体(kngt)技术，获技术，获1984年年诺贝尔奖诺贝尔奖第40页/共50页第四十一页，共51页。显微显微(xin wi)操作技术操作技术 micromanipulation technique第41页/共50页第