农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素

1、二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素转化机制：与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens )和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes )。根癌农杆菌含有Ti质粒。 发根农杆菌含有Ri质粒。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌Ri质粒都具有一段转移 DNA (transfer DNA，乂称T-DNA),在农杆菌侵染植物时，T-DNA可以插入到植物基因 组中，使其携带的基因在植物中得以表达。由于T-DNA能够进行高频率的转移，而且Ti质粒和Ri质粒上可插入大到甚至150kb的外源基因，因此，Ti质粒和Ri质粒成

2、 为植物基因转化中的理想载体系统。1与农杆菌转化相关的基因与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和Ti质粒上T-DNA以外Vir区的基因。染色体基因包括 chvA、chvB、att、pscA、chvD以及chvB。它们大多编码 一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞 上。ChvD蛋白可能在低pH和磷酸饥饿情况下提高VirG蛋白的合成水平。ChvE与VirA 蛋白共同对virG起激活作用。原始的Ti质粒根据其功能的不同，可分为4个区：(1) T-DNA区：是在农杆菌侵染细胞时，从 Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA其携带的基因与肿瘤的形成有

3、关， 但与T-DNM身的转移与整合无关。T-DNA 上最重要的是两端的2个边界(LB和RB)，它们是T-DNA转移所必需的。只要其存在， T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，T-DNA的右边界在T-DNA勺整合中对于靶DN砒点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要.(2) 蠹性区：位于T-DNA以外的1个3040kb的区域内，该区段编码的基因但对 T-DNA的转移和整合非常重要.这些基因也称为Ti质粒编码蠹性基因(vir)。(3) 接合转移区：该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因(tra)，调控Ti质粒在 农杆菌问转移。(4) 复制起始区：该区段调控 Ti质粒的自我

4、复制。在遗传转化过程中除了Ti质粒上的基因参与外，还有农杆菌染色体基因。染色体基因包chvA、chvB、att、pscA、chvD以及chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细 菌附着于植物受伤细胞上。延伸因子 P对于农杆菌的生长非常重要，但非必需.高水平的糖结合蛋白一 ChvE可以扩大VirA蛋白对酚类物质的识别范围。结合ATP盒式转 运体类似物蛋白ChvD 参与Vir区基因的表达调控，chvD基因座中插入无启动子的 lacZ，农杆菌侵染力以及 Vir区基因表达量大大下降，ChvD突变体中virG组成型表达 侵染力则得以恢复，这一现象说明 ChvD通过影响v

5、irG表达控制蠹性。2 Vir基因的诱导表达机制在植物受到创伤后，创伤组织的细胞释放出创伤信号酚类化合物，如乙酰丁香酮。当农杆菌接受到此类信号时，其vir区基因可被诱导转录。另一类诱导化合物是组成植 物细胞壁的一些特异单糖，As和单糖可协同诱导Ti质粒上vir区基因的表达。Vir区 基因的活化首先是从virA基因开始的。VirA蛋白是一种结合在膜上的化学受体蛋白， 可直接对植物产生的酚类化合物感应，其感应部位可能位于胞质区域。VirA蛋白的胞质区域有自激酶的功能，自身被磷酸化激活后，使VirG蛋白活化。VirG蛋白是DNA结 合活化蛋白，可以以二体或多体形式结合到 vir启动子的特定区域，从而

6、成为其它 vir 基因转录的激活因子，打开 VirB、virC、virD、virE、virH 等几个基因。ChvE可大大 增强vir基因被As诱导的效果,ChvE可结合一些单糖，也可直接与VirA周质区相互 作用，以加强As对Vir基因的诱导。3 T-DNA复合物的形成T-DNA的加工与转移是由Vir基因被诱导后产生的蛋白完成。VirD基因编码的两个产 物VirDI和VirD2直接参与加工过程。VirDI蛋白是一种拓扑异构酶，可将超螺旋型DNA 变成松弛型DNA VirD2蛋白具有特异剪切单链 DNA的内切酶活性，它可以识别 T-DNA 底链边界重复序列上的特定位点，并在底链24 bp重复序列

7、和第四个碱基之间切割，将T-DNA从Ti质粒上剪切下来，称为T-strand 或T-链。切开T-DN知，VirD2蛋白与 T-链的5,端共价结合，避免核酸外切酶降解 T-链。新的T-DNA底链以此链为棋板，从 右端产生的DNA缺口处以5' -3'方向进行合成。被取代的旧链游离出来，与许多VirE2 蛋白分子结合组成T-DNA复合体。此外，VirD2作为一个导向蛋白，可以指导整个T-DNA 复合体（或叫T-复合体）从农杆菌进入到植物细胞核。4 T-DNA复合物的跨膜转运农杆菌的T-DNA转移通道由多达12种蛋白组成，包括两个主要部分：纤毛附届丝（或 纤毛）和膜结合复合体。该通道也

8、可称为 T-复合体运输器，由virB编码的11种蛋白 和VirD4蛋白组成。VirB1可在细菌膜上为T-复合体运输器的装备提供位点；VirB2和 VirB5可被移动到细胞表面形成纤毛；其余的 VirB、VirD4为T-复合体的运输提供能 量。合成的T-复合体经过T-复合体运输器，以类似于细菌转导过程的方式注射到植物 细胞内，并在VirD2和VirE2的核定位信号（NLS序列引导下，以VirD2为先导向植 物细胞核运动。在人工构建的质粒中，vir基因和T-DNA可以放在同一个质粒上，也可 以放在不同的质粒上。影响转化效率的因素1、菌株染色体背景不同农杆菌株的类型的chv基因决定了其对受体细胞的识

9、别和附着能力的差异。根癌农杆菌的胭脂碱型和琥珀碱型生长快、不结球，转化易于操作，但共培养时菌体附着能力 较差：章鱼碱型则生长慢、易结球，转化难于操作，但共培养时菌体附着后不易洗去。2、共培养方式农杆菌转化的共培养介质可以是细菌培养基或植物受体培养基。烟草等对农杆菌侵染比 较敏感的植物的共培养时间一般较短，液体细菌培养基介质应用较多。许多单子叶植物 等不敏感植物受体与农杆菌共培养时间一般较长，用细菌培养介质容易造成农杆菌过度 繁殖，导致植物外植体呼吸作用抑制和细菌分泌物蠹害，因此多采用液体植物培养基作 为共培养介质。3、侵染浓度和时间农杆菌适宜的侵染浓度和时间因外植体对侵染的敏感性不同而有很大差

10、异。浓度过高、 时间过长会引起农杆菌细胞间的竞争性抑制，而且过度增殖会抑制受体细胞的呼吸作 用；浓度过底、时间过短则造成受体细胞表面农杆菌附着不足。禾谷类作物一般侵染浓 度较高，Hiei用LBA4404(pTOK233化水稻的最佳接种浓度为 OD600=0.81.0, Ishida 用LBA4404(pSB131舷化玉米幼胚采用的侵染浓度为 OD600=2.Q但烟草、大白菜等对 侵染敏感的双子叶植物要求菌体浓度要低的多，一般为OD600= 0.5。4、共培养条件(1) 共培养温度 农杆菌在2030C的范围内都可以生长，不同研究结果中vir区基因 表达的适宜温度有一定差异，但多数在 2025C获

11、得较高的表达水平。外植体生长温 度也一般在此范围内，所以通常选取外植体的最佳生长温度为共培养温度， 通常在25C 左右0(2) 共培养PH值研究人员普遍认为酸性培养环境有利于农杆菌的侵染。因为植物细 胞释放的对农杆菌有趋化作用的化学物质(如酚类、糖类)虽然在不同酸碱度下比较稳 定，但在pH=5.05.8时对vir基因的诱导能力最高。(3) 诱导物和抑制物 酚类是vir区基因表达的主要信号物质。酚类物质产量低一度 被认为是影响农杆菌转化，特别是单子叶植物转化的主要原因之一。在众多的酚类物质中，乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮诱导能力较强，AS的促进效果与菌株类型、植物材料种类和共培养培养基的pH值有关

12、。没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚、儿茶酚、对羟 基苯酚等多酚混合处理农杆菌也有很高的作用，但不同酚类物质是否有累加效应在不同 研究结果中不近相同。不同农杆菌类型对酚类物质的敏感性不同，根癌农杆菌的章鱼碱 株系比胭脂碱系需要更高的酚类物质诱导，发根农杆菌的农杆碱型比甘露碱型对酚类物质刺激的敏感性更低。糖类等小分子，这些小分子一方面可作为化学源吸引农杆菌的趋化运动，另一方面可诱导或抑制农杆菌 vir基因的表达。而糖类的主要作用是与农杆菌染色体蠹性蛋白 ChvE结合，激活virA蛋白进而诱导vir基因高水平表达和扩大农杆菌的寄主范围。特别 在AS浓度很低的情况下,它们可强烈诱导vir基因的表达，并且

13、与AS存在协同效应，可 显著提高AS诱导效果。糖类在不含酚类化合物的情况下效果较明显，但是糖类和酚类化 合物同时存在时却没有明显的协同效应。多胺也参与植物宿主和病原之间的相互作用。Kumar等曾用多胺物质对农杆菌进行 活化后侵染烟草做GUS舜时表达研究，结果表明农杆菌的侵染活力显著提高（4）共培养时激素的添加、有无光照共培养培养基中添加生长素、细胞分裂素对转化更有利。而光照的有无要是植物种类而 异。5、受体类型和生理状态不同基因型对农杆菌侵染敏感性有差异。 目前用过的受体材料有叶盘、叶柄、根尖根段、 茎尖茎段、幼穗、花药、子叶（柄）、胚或其部分结构（胚轴）、芽等，可以看出分生组 织是较通用的受

14、体。分生能力强的植物细胞对农杆菌敏感，活跃的细胞分裂促进了 T-DNA的整合。6、预培养培养基外植体进行共培养前，在含有外源激素的培养基上预培养一段时间，使植物组织代谢活 跃,促进细胞分裂，分裂状态的细胞更易整合外源 DNA从而提高外源基因的瞬时表达和 转化率。有人认为，在预培养时降低钙的含量会促进农杆菌的侵染。钙在对致病微生物 抵抗方面起到重要作用，而钙的不足会引起细胞壁结构的改变 ，这种改变使农杆菌更容 易附在愈伤上，增强农杆菌对愈伤的感染能力。7、接种方式比较常用的接种方式是将外植体置于侵染液中浸泡，时间长短视菌种和外植体种类而异。有的研究者在浸泡的基础上结合了振荡进行接种，振荡培养能打破细胞表面的气泡， 使农杆菌与外植体的接触面增大，有利于农杆菌侵染。近年来，在提高遗传转化效率方面 发展了一些新技术，如超声波辅助农杆菌介导法、负