论RECK在宫颈癌中的表达及意义

1、论 RECK在宫颈癌中的表达及意义摘要：目的 检测基质金属蛋白酶抑制剂RECK在宫颈癌组织中的表达，探讨其对血管生成的影响。方法实验组 ( 宫颈癌组织 )26 例以及对照组 ( 正常宫颈上皮、慢性宫颈炎组织 )24 例，应用免疫组化法，经细胞计数及灰度测量检测 RECK的表达，计数微血管密度 (MVD)的值。比较二者的差异性。 结果 RECK的表达在实验组的灰度值 (7 ±1 ) 明显低于对照组 (657±30 )(P)。 MVD值在实验组 ( 5 ± 8) 明显高于对照组 ( 0± 9)(P关键词： RECK; 基质金属蛋白酶 ; 宫颈癌 ; 微血管密

2、度恶性肿瘤侵袭正常组织及转移必须突破细胞外基质(ECM)尤其是基底膜屏障。而基质金属蛋白酶 (MMP)在 ECM及基底膜的降解过程中起到主导作用，能够促进肿瘤的侵袭转移和血管生成。 MMP抑制剂作为肿瘤治疗的新药物早已引起人们的重视。 RECK(reversioninducingcysteinerich proteinwith kazal motifs) 基因是近年来发现的新型MMP抑制剂，其转录后水平抑制MMP特别是、以及膜型基质金属蛋白酶的表达与活性，主要抑制肿瘤的血管生成以及侵袭转移1。国内外学者通过对乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等组织的体外实验研究表明：在恶性肿瘤组织中，RECK的表达显著

3、降低，并与肿瘤及淋巴转移有关 ; 但对 RECK与肿瘤的分期及分化程度关系意见不一致 2，3。本实验主要探讨 RECK在宫颈癌中的表达情况，及与宫颈癌发展、侵袭及转移的关系以及对血管生成的作用，为宫颈癌的基因靶向治疗建立一个新的起点。1 资料与方法标本来源 选择 20XX年 3 月 20XX年 3 月在吉林大学第二医院、吉林大学第一院、长春市妇产医院、省肿瘤医院进行手术治疗的 50 例患者的宫颈组织。分为试验组及对照组。试验组 26 例：经病理组织证实为宫颈癌，术前患者均未行放疗、化疗和免疫治疗，年龄 33 72 岁，平均年龄 (48 ±) 岁。其中期 19 例，a期 4 例，b期

4、2 例，a期经 2 个疗程化疗后 1 例 ; 高分化 9 例，中分化 13 例，低分化 4 例 ; 鳞癌 21 例，腺癌 4 例，腺鳞癌 1 例 ; 盆腔淋巴结转移 2例 ; 脉管转移 2 例。对照组 24 例，包括癌旁组织 16 例、慢性宫颈炎 8 例。两组在年龄上无统计学差异。试剂 鼠抗人 RECK蛋白多克隆抗体购自美国 Santa Cruz 生物制品公司，鼠抗人因子单克隆抗体购自福州迈新生物技术有限公司， 其他试剂采用进口或国产分析纯试剂。方法标本采集广泛性子宫切除或全子宫切除标本，立即用4预冷双刃刀片从宫颈组织上切取1 cm3 大小组织，投入 10%甲醛溶液中， 4保存，供制备光镜标本

5、用。组织经固定、脱水、包埋、5 m连续切片。实验方法将切片进行 HE染色和免疫组化。用做灰度分析 (IOD) ，半定量计量 RECK阳性率及 IOD 值，计数 MVD值。结果判定RECK细胞计数判断标准： 400 倍镜下观察，在肿瘤细胞膜和 /或细胞质有黄棕色或玫瑰红色颗粒沉着为RECK阳性染色。根据染色程度和染色细胞百分率进行评分：基本不着色为0 分，淡为 1 分，适中为 2 分，深为 3 分;着色细胞占计数细胞百分率 5%为 0分，6%25%为 1 分，26% 50%为 2 分，51%为 3 分。将平均着色程度得分与平均着色细胞百分率得分相乘为其最后得分：1分为阴性 (-) ，23 分为

6、(+) ， 4 6 分为，>6 分为。 MVD计数结果判定标准：细胞间质内孤立的棕黄色血管内皮细胞或细胞簇或血管腔内径小于8个红细胞直径且管壁无肌层者代表 1条单独的微血管。先在低倍 ( ×100) 视野下找到肿瘤组织内微血管密度最高的区域 ( 热点 ) ，然后在高倍 ( ×400) 视野下计数 5 个视野的微血管数，取其平均值。统计学方法 使用进行数据分析， RECK检测结果细胞计数以 (- 表示，灰度分析以 IOD 均值及标准差表示， MVD结果以均值及标准差表示。组间进行独立样本 2 检验、 t 检验及双变量相关性分析。2 结 果宫颈癌组织及对照组中 RECK的

7、表达 RECK在胞浆和胞膜处表达明显，宫颈间质中有适度表达，呈广泛性弥漫 ( 见图 1) 。RECK在宫颈癌组织中阳性表达11 例(%)，而在对照组中呈高表达，阳性表达 22 例(%)，组间比较有显著性差异 (P= 2) 。 26 例宫颈癌组织 IOD 为 7 ±1 ， 24 例对照组为 657 ±30 ，经 t 检验，宫颈癌组 IOD 值低于对照组，差异有统计学意义 (t = 5， P=)( 见表 1) 。两种方法检验结果一致。宫颈癌组织中 RECK表达与肌层浸润和淋巴结转移的关系RECK在宫颈癌中表达与肌层浸润深度、盆腔淋巴结转移有关经组间 2 检验，(P) 。深肌层间

8、质浸润、有盆腔淋巴结转移者，其RECK阳性表达率分别显著低于浅肌层浸润、无盆腔淋巴结转移者(P= 4;P= 7)。不同病理参数下RECK表达见表2。表1两组RECK的表达表 2 RECK的表达与宫颈癌临床病理参数的关系宫颈癌 MVD的表达情况及与 RECK的相关性分析 镜下观察血管染色结果，在宫颈癌组织中，微血管排列紊乱，着色不均一，大小不等，形状不规则，血管壁厚度不均 ( 见图 2) ，而对照组中血管内皮细胞表达较清晰，形状规则，呈圆形或椭圆形，管壁厚度均匀。宫颈癌组中 MVD明显高于对照组 (P= 0) 。经线性回归分析，26 例宫颈癌组织 RECK表达与 MVD值呈负相关 (r=-,P=

9、 5)( 见表 3) 。表 3 宫颈癌和对照组中 MVD的表达及与 REOK的相关性分析3 讨 论RECK基因是由日本学者ChiakiTakahashi 等人在转染了基因的 NIH3T3细胞系表达的 cDNA中分离出来的转录抑制基因。 在正常组织或无肿瘤细胞系中广泛表达， 而在癌基因转染的成纤维细胞或肿瘤细胞中低表达或无表达。RECK在转录后水平抑制MMP(特别是、的分泌与活性，还可以抑制和从细胞内的释放，从而抑制肿瘤的血管生成、浸润和转移4。RECK在正常组织中高表达，而在各种肿瘤来源的细胞系及转染了Ras等癌基因的细胞中不表达。本研究表明， RECK表达呈弥散状，呈棕黄色或棕褐色颗粒样物质

10、，主要分布在胞膜和 / 或胞浆中，部分标本可见间质内表达。 在对照组中，RECK呈高表达，而在宫颈癌组织中RECK的阳性表达率显著降低(p=)。这与国内外报道相符。癌基因可以抑制RECK的表达，说明RECK可能是癌基因作用的靶位点 5。Cho 2利用 DNA甲基转移酶抑制剂氮胞苷作用于被甲基化的RECK，恢复其化学结构， 结果 RECK表达上调。 说明癌组织中 RECK被甲基化从而表达降低。Rabien 等指出RECK在前列腺癌中的表达明显低于前列腺增生组织6。Song 等 3证实胃癌组织中 RECK的表达与肿瘤的镜下生长(P=) 、淋巴浸润 (P=) 、淋巴结转移 (P=) 相关，随肿瘤侵袭

11、能力增强而表达下降。本研究发现，RECK基因的表达与宫颈癌FIGO临床分期、组织学分级、组织学分型、患者年龄无关，与癌组织肌层间质浸润深度、 盆腔淋巴结转移相关。浸润深度累及深肌层或更深、盆腔淋巴结转移阳性组，RECK表达明显下降 (P=这 4,P= 7) 。Oh等 4用携带 RECK基因的载体转染HT 1080 人纤维肉瘤细胞并将其接种到裸鼠体内，发现肿瘤中血管密度降低，血管出芽受到抑制，血管腔增大。基因敲除研究发现， RECK基因的适量表达可以抑制血管的生成。研究表明，RECK作用的过程在于血管的成熟过程，而不是血管生成过程。有研究表明，和通过增强RECK表达介导的时间依赖机制抑制基质微血

12、管上皮细胞 (hMVEC)的迁移。加强了Crk和 C3G之间的信号传导，导致Rap1基因活性增加，与Rap1表达不活跃的细胞株相比，hMVEC稳定表达。说明、Rap1基因能上调RECK的表达，使血管迁移减少7。本研究表明，RECK表达阳性组织中微血管结构清晰， 管腔增大且形状规则，呈椭圆或圆形， 着色较深。 而宫颈癌组织的微血管管壁菲薄且着色不均， 管腔狭小且形状不规则 ; 宫颈癌组织中 MVD值明显高于对照组，相关性分析表明 MVD值与 RECK表达呈负相关说明 RECK的表达可以抑制肿瘤血管的生成， 与国外报道相似。总之，本研究表明宫颈癌组织中 RECK的表达水平显著降低， RECK低表达

13、的肿瘤具有更强的侵袭和淋巴转移能力， 其表达与宫颈癌 MVD有密切关系，故二者可望成为早期诊断宫颈癌及判断预后新的指标。对 RECK基因的深入研究不但有利于更进一步了解肿瘤的生物学行为， 还可以为研究抗肿瘤药物提供新的思路。【参考文献】1 Toshimichi A，Mitsuhiro Tmetalloproteinasefamilyexpression， Cheng SQ,et values of matrixin humancolorectalcarcinoma J.Surg Res ，20XX;146(1) ：2 Cho CY，Wang JH，Chang HC,et inactivatio

14、n of the metastasissuppressorRECKenhances invasionof humancolon cancer cells J. CellPhysical ，3 Sang YS，Hee JS，Nam E,et of reversion inducing cysteine richprotein with Kazal motifs (RECK) as a prognostic indicator in gastriccancer J .Eur Cancer ，4 Oh J,Takahashi R，RECKis a key regulatorof extracellularmatrixintegrityand angiogenesis J .Cell ，suppressor RECK via ERK and Sp transcription factors to promote cellinvasion J.Biol Chem ，6 Rabien，Ergun，Lein M,et matrixmetalloproteinaseinhibitorREC