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1、 酵母质粒抽提方法 点击次数： 247 作者：ydniu 发表于：2008-06-18 11:44 转载请注明来自丁香园 来源：丁香园 问：想从酵母提取质粒，转化大肠杆菌，按分子克隆的方法，可能都线性化了，转化率为 0,请问有 什么好的办法？ 答：以下是我的方法，曾提过数百个，好像转化效率还可以 ，基本上都提岀来了。 个人体会是 Lyticase的活性要好，而且涡流混匀这一步好像要尽量充分吧， u see，酵母质粒所以不 好提，就是因为酵母细胞有很厚的细胞壁，再加上酵母质粒拷贝数目多少的问题，所以破壁一定要充分。 其次吗？感受态细胞的状态也会有很大的影响 再有，如果担心酵母细胞的活性问题，也可

2、以活化一下 再提，不过好象我的实验中这项不是问题 .哈哈. 详细步骤： 1、挑 10mm2的酵母溶于含 50 gl的 TE ( pH7.0)的 1.5ml离心管中 2、每管加 10 g 1的裂解液(Lyticase 5 unit/ gSjgma避光保存)，涡流混匀 3、37 C，200-250r/m，30-60min 4、每管加 10 g l 20 % SDS，涡流 1min 5、E0C冻存过夜 6、室温下融解后，涡流混匀 质粒提取。 1.5ml 离心管加 TE Buf 至 200 gl 的（pH7.0 ） 200gl酚，涡流 5min 后，4C, 14000r/m 离心 10min。 取上清

3、至干净的 1.5ml Eppendorf 管中。 等体积酚氯仿，涡流 5min 。 4C， 14000r/m 离心 10min 。 取上清至一干净的 1.5ml Eppendorf 管后加等体积氯仿，涡流混匀 4C， 14000r/m 离心 10min 。 取上清至一干净的 1.5ml Eppendorf 管中。 8gl 10M NH4Ac 和 500gl 95%100 %的乙醇。 -70 C, 1h。 4C， 14000r/m 离心 10min 。 弃上清，空气中干燥。 10g l H2O 悬浮细胞。 转化（要求：4 C预冷） 冰上融化感受态细胞（感受态细胞的制备见分子克隆啦） Top10f 加 100gl转化细胞到预冷的 1.5ml离心管中，枪头轻轻吹打混匀。 冰上孵育 30min 。 42 C, 45S 50S。 冰上孵育 2min 后，加 1ml LB 。 37C， 1h， 250r/m. 2500r/m ， 5min ， RT。 弃上清，在剩余的溶液中悬细胞。 接种 LB/Amp 板， 37 C ，倒置培养 24h。7、 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 7.10 7.11 7.12 7.13 8、

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