生物制药工艺学 第四章

1、第4章 氨基酸类药物一氨基酸类药物的基本知识一氨基酸类药物的基本知识第一节第一节 氨基酸类药物的基本概念氨基酸类药物的基本概念 H2NCHCOOHR-氨基酸表达通式氨基酸表达通式PrPr的基本组成单位（构成的基本组成单位（构成天然天然PrPr的的2020种种AaAa）均为均为L-L-氨基酸氨基酸(RH,NH(RH,NH2 2,COOH),COOH)GlyGly（R RH H）除外）除外不同不同AaAa即有共性又有个性即有共性又有个性具有立具有立体异构体异构现象现象H HN N H H3 3+ +C C O O O O- -C C H H3 3+ +H H3 3N NH HC C O O O O

2、- -C C H H3 3D-AlanineD-AlanineL-AlanineL-Alanine(Fischer projections)(Fischer projections)氨基酸的立体构型氨基酸的立体构型（丙氨酸）（丙氨酸）作为药物使用的主要是天然氨基酸，即作为药物使用的主要是天然氨基酸，即L L氨基酸氨基酸D D氨基酸主要用于：氨基酸主要用于：1 1）新型抗生素、抗病毒药的中间体）新型抗生素、抗病毒药的中间体 2 2）食品、化妆品领域）食品、化妆品领域 3 3）生化试剂领域）生化试剂领域D-D-苯丙氨酸是苯丙氨酸是HIVHIV蛋白蛋白酶抑制药的关键中间体，酶抑制药的关键中间体，也是

3、抗肿瘤药（百士欣）也是抗肿瘤药（百士欣）和糖尿病治疗药（纳格和糖尿病治疗药（纳格列那）的原料列那）的原料D-D-氨基酸构成氨基酸构成的二肽或者短的二肽或者短肽，它们甜度肽，它们甜度高，安全，无高，安全，无热量热量 （1）根据氨基酸在）根据氨基酸在pH5.5溶液中带电状况分为溶液中带电状况分为 酸性酸性Aa Aa(PI2.8-3.2 中性中性Aa(PI6.2-6.8 碱性碱性Aa Aa(PI9.7-10.7 （2）依）依R基团差异分为基团差异分为 脂肪族脂肪族Aa 芳香族芳香族Aa 杂环杂环Aa 1 1、分类（了解）、分类（了解）（1 1）物理通性：）物理通性： 外观外观：白色结晶性粉末：白色结

4、晶性粉末 熔点熔点( (及分解点及分解点) )均均200200。 溶解度溶解度：水中各不相同，有机溶剂中一般较小。：水中各不相同，有机溶剂中一般较小。 等电点等电点: :均为两性电解质，有各自均为两性电解质，有各自PIPI。 旋光性旋光性: :除除GlyGly外外 ，均有旋光性。，均有旋光性。2 2、性质、性质( (熟悉）熟悉）（2）化学通性：）化学通性： 两性解离两性解离及酰化、烷基化、酯化、酰氯化、酰胺化、及酰化、烷基化、酯化、酰氯化、酰胺化、叠氮化、脱羧及脱氨反应、肽键结合反应及与甲醛和叠氮化、脱羧及脱氨反应、肽键结合反应及与甲醛和亚硝酸的反应、林海定反应等。亚硝酸的反应、林海定反应等。

5、 H2NCHCOOHRR CH COO- NH3+R CH COO- NH2+ H+R CH COO- NH3+R CH COOH NH3+ H+（3） 特殊基团反应特殊基团反应 酪氨酸的酪氨酸的酚羟基酚羟基可产生可产生米伦反应米伦反应与与福林达尼斯反福林达尼斯反应应； 精氨酸的精氨酸的胍基胍基产生坂口反应；产生坂口反应； 色氨酸的色氨酸的吲哚基吲哚基与芳醛产生红色反应；与芳醛产生红色反应；含有酪氨酸的物质或其他酚类含有酪氨酸的物质或其他酚类化合物与米伦试剂（亚硝酸汞、化合物与米伦试剂（亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混合液硝酸汞及硝酸的混合液 ）一起）一起加热出现红色反应的现象加热出现红色反应的现象

6、 酚基将福林试剂酚基将福林试剂中的磷钼酸及磷中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色钨酸还原成蓝色化合物的反应化合物的反应 以以萘酚和次氯酸萘酚和次氯酸处理样品后，精氨处理样品后，精氨酸出现的红色反应酸出现的红色反应 1 1、氨基酸的营养价值、氨基酸的营养价值 必需必需Aa：人及哺乳动物自身不能合成：人及哺乳动物自身不能合成,需由食物供应需由食物供应 包括赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、亮包括赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸等氨酸、异亮氨酸及缬氨酸等8种种 非必需非必需Aa：必需必需Aa以外的氨基酸以外的氨基酸 半必需半必需Aa：胱氨酸及酪氨酸：胱氨酸及酪氨酸;

7、精氨酸及组氨酸精氨酸及组氨酸2 2、氨基酸的药理效应、氨基酸的药理效应 治疗消化道疾病、肝病、肿瘤等治疗消化道疾病、肝病、肿瘤等二、氨基酸及其衍生物在医药中的应用（了解）二、氨基酸及其衍生物在医药中的应用（了解） 1）治疗消化道疾病的氨基酸及其衍生物治疗消化道疾病的氨基酸及其衍生物 谷氨酸、谷氨酰胺、乙酰谷酰胺铝、甘氨酸、组氨酸谷氨酸、谷氨酰胺、乙酰谷酰胺铝、甘氨酸、组氨酸盐酸盐盐酸盐 2）治疗肝病的氨基酸及其衍生物治疗肝病的氨基酸及其衍生物 精氨酸盐酸盐、鸟天氨酸、谷氨酸钠、蛋氨酸、瓜氨精氨酸盐酸盐、鸟天氨酸、谷氨酸钠、蛋氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、天冬氨酸酸、赖氨酸、天冬氨酸 3 3）治疗脑及神

8、经系统疾病的氨基酸及其衍生物治疗脑及神经系统疾病的氨基酸及其衍生物 谷氨酸、酪氨酸、色氨酸、谷氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-5-羟色氨酸羟色氨酸、左旋多巴左旋多巴 4 4）用于肿瘤治疗的氨基酸及其衍生物用于肿瘤治疗的氨基酸及其衍生物 偶氮丝氨酸、氯苯丙氨酸、磷乙天冬氨酸偶氮丝氨酸、氯苯丙氨酸、磷乙天冬氨酸 5 5）其它氨基酸类药物的临床应用其它氨基酸类药物的临床应用 胱氨酸、半胱氨酸胱氨酸、半胱氨酸 （抗辐射损伤）（抗辐射损伤） 第二节第二节 氨基酸类药物的生产方法氨基酸类药物的生产方法1 1、氨基酸生产现状、氨基酸生产现状 20102010年我国年我国AaAa总产量总产量300300万吨万吨,

9、,其中谷氨酸其中谷氨酸200200万吨万吨, ,占世占世界谷氨酸产量的界谷氨酸产量的2/3.2/3.产量产量: :谷氨酸谷氨酸 蛋氨酸蛋氨酸 赖氨酸赖氨酸 天门冬氨酸天门冬氨酸 苯丙氨酸苯丙氨酸 胱氨胱氨酸酸 ( (谷氨酸是全球产销量最大的谷氨酸是全球产销量最大的AaAa, ,占占80%)80%)2 2、氨基酸的应用领域、氨基酸的应用领域（1 1）调味品及食品添加剂调味品及食品添加剂 约占约占50%50%（2 2）动物饲料动物饲料 约占约占30%30%（3 3）药用、保健品、化妆品及其他药用、保健品、化妆品及其他 约占约占20%20%概述概述3、氨基酸类药物的生产方法、氨基酸类药物的生产方法a

10、.天然蛋白质天然蛋白质 一、水解法一、水解法（一）基本原理与过程（一）基本原理与过程 （了解）（了解） 天然蛋白（毛发、血粉、废蚕丝）天然蛋白（毛发、血粉、废蚕丝）（1 1）水解）水解多种氨基酸多种氨基酸混合物混合物（2 2）分离纯化（）分离纯化（3 3）精制）精制 （结晶）（结晶）药用氨基酸药用氨基酸 水解法生产的氨基酸种类水解法生产的氨基酸种类 L-胱氨酸、胱氨酸、L-精氨酸、精氨酸、L-亮氨酸、亮氨酸、L-异亮氨酸、异亮氨酸、L-组组氨酸、氨酸、L-脯氨酸及脯氨酸及L-丝氨酸等。丝氨酸等。 蛋白质水解方法（熟悉）蛋白质水解方法（熟悉） 酸酸水解法水解法 碱碱水解法水解法 酶酶水解法水解法

11、 1 1、蛋白质水解方法（熟悉）、蛋白质水解方法（熟悉）（1 1）酸水解法）酸水解法 蛋白质原料蛋白质原料6 610mol/L HCL10mol/L HCL或或8mol8molL LH H2 2SOSO4 4 水解水解110110120120，121224h24h除酸除酸多种氨基多种氨基酸混合物酸混合物水解液水解液 特点分析特点分析 优点：优点：水解迅速、彻底，产物均为水解迅速、彻底，产物均为L-L-氨基酸，氨基酸，无消旋作用无消旋作用缺点：缺点：色氨酸色氨酸全部被破坏，全部被破坏，丝氨酸及酪氨酸丝氨酸及酪氨酸部分被破坏部分被破坏, ,有大有大量废酸产生，污染环境。量废酸产生，污染环境。色氨酸

12、色氨酸丝氨酸丝氨酸（2 2）碱水解法）碱水解法 蛋白质原料蛋白质原料6mol/L NaOH6mol/L NaOH或或4mol/L BaOH4mol/L BaOH 水解水解100100， 6h6h多种氨基酸混合物多种氨基酸混合物 特点分析特点分析 优点优点：水解迅速、彻底，色氨酸不被破坏：水解迅速、彻底，色氨酸不被破坏 缺点缺点：羟基或巯基的氨基酸全部被破坏，且：羟基或巯基的氨基酸全部被破坏，且产生消旋作用产生消旋作用（工业上多不采用工业上多不采用）。）。酪氨酸酪氨酸（3 3）酶水解法）酶水解法 特点分析特点分析 优点：优点：反应条件温和，无需特殊设备，氨基酸不破坏，反应条件温和，无需特殊设备，

13、氨基酸不破坏，无消旋作用。无消旋作用。 缺点：缺点：水解不彻底，产物中除氨基酸外，还较多肽类。水解不彻底，产物中除氨基酸外，还较多肽类。 蛋白质原料蛋白质原料 蛋白水解酶蛋白水解酶T T，pHpH氨基酸和小肽氨基酸和小肽工业上很少用该法生产氨基酸而主要用于生产工业上很少用该法生产氨基酸而主要用于生产水解蛋白水解蛋白及蛋白胨及蛋白胨。 2 2、氨基酸分离方法、氨基酸分离方法 （掌握）（掌握） （2 2）特殊试剂沉淀法）特殊试剂沉淀法 原理：某些有机或无机试剂与相应氨基酸形成不溶性原理：某些有机或无机试剂与相应氨基酸形成不溶性衍生物衍生物 例：例：亮氨酸亮氨酸能与能与邻二甲苯邻二甲苯4-4-磺酸磺

14、酸形成不溶性盐沉淀形成不溶性盐沉淀组胺酸组胺酸与与HgCLHgCL2 2形成不溶性汞盐沉淀形成不溶性汞盐沉淀 精氨酸精氨酸与与苯甲醛苯甲醛生成苯亚甲基精氨酸沉淀生成苯亚甲基精氨酸沉淀n利用此反应可从混合氨基酸溶液利用此反应可从混合氨基酸溶液( (如猪血粉水解液如猪血粉水解液) )中中分别分离分别分离L-L-亮氨酸亮氨酸, ,组氨酸组氨酸, ,精氨酸精氨酸（3 3）吸附法）吸附法 原理：原理：吸附剂吸附剂对不同氨基酸对不同氨基酸吸附力的差异吸附力的差异 例：例：颗粒活性炭颗粒活性炭对苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的吸附对苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的吸附力大于对其它非芳香族氨基酸的吸附力力大于对其它非芳香

15、族氨基酸的吸附力, ,可从氨基酸混可从氨基酸混合液中分离上述氨基酸合液中分离上述氨基酸 指表面能发生吸附作用的指表面能发生吸附作用的固体，一般为多孔微粒或固体，一般为多孔微粒或多孔膜，具有较大比表面多孔膜，具有较大比表面积积物理吸附物理吸附化学吸附化学吸附离子交换吸附离子交换吸附（4 4）离子交换法）离子交换法 原理：利用原理：利用离子交换剂离子交换剂对不同氨基酸对不同氨基酸吸附能力的差异吸附能力的差异。在特定条件下，不同氨基酸的带电性质及解离状态不在特定条件下，不同氨基酸的带电性质及解离状态不同，因此同一种离子交换剂对不同氨基酸的吸附力不同，因此同一种离子交换剂对不同氨基酸的吸附力不同，可实

16、现氨基酸混合物的分组或单一成分分离同，可实现氨基酸混合物的分组或单一成分分离静电相互作用力静电相互作用力差异差异离子交换树脂离子交换树脂通常用于氨基酸等小分子物质的分离通常用于氨基酸等小分子物质的分离离子交换纤维离子交换纤维, ,离子交换葡聚糖离子交换葡聚糖, ,离子交换树脂离子交换树脂离子交换树脂上所带的功能基团通常分为强酸离子交换树脂上所带的功能基团通常分为强酸性性(R-SOR-SO3 3H),H),弱酸性弱酸性(-COOH),(-COOH),强碱性强碱性( (三甲胺基三甲胺基) )和弱碱性和弱碱性( (伯胺基伯胺基, ,仲胺基仲胺基, ,叔胺基叔胺基) )离子交换剂的结构组成离子交换剂的

17、结构组成共价结合平衡离子离子交换基本过程Starting conditionsAdsorptions on sample substancesStart of desorptionEnd of desorptionregenerations3 3、氨基酸的精制方法、氨基酸的精制方法 a.a.结晶结晶和和重结晶重结晶技术技术; ; b. b.结晶与溶解度法相结合结晶与溶解度法相结合的技术。的技术。 （1 1）结晶和重结晶）结晶和重结晶 丙氨酸在稀乙醇或甲醇中溶解度较小，且丙氨酸在稀乙醇或甲醇中溶解度较小，且pIpI为为6.06.0，故丙氨酸可在，故丙氨酸可在pH6.0pH6.0时，用时，用505

18、0冷冷乙醇结晶或重结晶加以精制。乙醇结晶或重结晶加以精制。（2) 2) 溶解度与结晶技术相结合的方法溶解度与结晶技术相结合的方法 在沸水中苯丙氨酸溶解度大于酪氨酸在沸水中苯丙氨酸溶解度大于酪氨酸100100倍倍 苯丙氨酸粗品苯丙氨酸粗品( (含少量酪氨酸含少量酪氨酸) )1515倍体积热水倍体积热水调调pH4.0pH4.0溶解溶解脱色脱色过滤过滤滤液滤液浓缩浓缩浓缩液浓缩液9595乙醇，乙醇，44结晶结晶9595乙醇乙醇 洗涤洗涤烘干烘干苯丙氨酸精品苯丙氨酸精品除去大部分酪除去大部分酪氨酸氨酸（二）用水解法生产氨基酸的品种及工艺（二）用水解法生产氨基酸的品种及工艺（了解）（了解） L-L-亮氨

19、酸（亮氨酸（L-LeucineL-Leucine，L-leuL-leu）的制备）的制备（1 1）结构与性质）结构与性质 来源来源：玉米麸质及血粉，角甲、棉籽饼和鸡毛。：玉米麸质及血粉，角甲、棉籽饼和鸡毛。 外观外观：白色片状结晶：白色片状结晶 溶解性溶解性 2525水中溶解度为水中溶解度为2.192.19，乙醇中为，乙醇中为0.017;0.017; 75 75水中为水中为3.823.82，在醋酸中为，在醋酸中为10.910.9，不溶于乙醚。，不溶于乙醚。 pIpI为为5.985.98，熔点，熔点为为293293 a a20201616o o（C=0.5-2.0,C=0.5-2.0,在在5mol

20、/HCL5mol/HCL中）中）a a25251111o o（C=0.5-2.0,C=0.5-2.0,在水中）在水中） （2 2）工艺路线）工艺路线水解：水解：110-120 110-120 回流水解回流水解赶酸：减压浓缩至糊状，加水稀释，重复赶酸三次赶酸：减压浓缩至糊状，加水稀释，重复赶酸三次吸附、脱色：颗粒活性炭柱，进样吸附至流出液出现苯丙氨酸为止，吸附、脱色：颗粒活性炭柱，进样吸附至流出液出现苯丙氨酸为止，去离子水洗至流出液去离子水洗至流出液pH4.0pH4.0为止，穿柱液与洗涤液合并为止，穿柱液与洗涤液合并沉淀：特殊试剂沉淀法（邻二甲苯沉淀：特殊试剂沉淀法（邻二甲苯4 4磺酸）磺酸）解

21、析：沉淀水洗两次，抽滤，滤饼加去离子水，氨水调解析：沉淀水洗两次，抽滤，滤饼加去离子水，氨水调pHpH至至6-86-8，70-70-8080保温搅拌保温搅拌1 1，冷却，过滤，沉淀再水洗两次，冷却，过滤，沉淀再水洗两次二、发酵法二、发酵法 （）基本原理与过程（）基本原理与过程 1、发酵的基本原理、发酵的基本原理 利用利用微生物细胞中酶微生物细胞中酶的作用，将培养基中有机物转化的作用，将培养基中有机物转化为细胞或其它有机物的过程。为细胞或其它有机物的过程。发酵法是一个从头合成的生物过程，涉及多种酶的参与，发酵法是一个从头合成的生物过程，涉及多种酶的参与，其原料主要是碳源、氮源、无机盐和微生物菌种

22、其原料主要是碳源、氮源、无机盐和微生物菌种 初生氨基酸初生氨基酸 微生物通过微生物通过固氮、硝酸还原固氮、硝酸还原及自外界吸收氨使及自外界吸收氨使酮酸氨酮酸氨基化基化成相应的氨基酸成相应的氨基酸(Gly, L-Ala, L-Asp ，L-Glu) 或微生物通过或微生物通过转氨酶转氨酶作用，将一种氨基酸的氨基转移作用，将一种氨基酸的氨基转移到另一种酮酸上，生成的新氨基酸到另一种酮酸上，生成的新氨基酸 (L-Ala, L-Asp ) 次生氨基酸次生氨基酸 在微生物作用下，以初生氨基酸为前体转化成的其在微生物作用下，以初生氨基酸为前体转化成的其它氨基酸它氨基酸(此类此类Aa占大多数占大多数）谷丙转氨

23、酶可使谷丙转氨酶可使GluGlu氨氨基转移到丙酮酸上生成基转移到丙酮酸上生成L LAlaAla谷草转氨酶可使谷草转氨酶可使Glu的氨基转移到草酰乙的氨基转移到草酰乙酸上生成酸上生成LAspL-Asp是是L-Lys的的前体，前体，LGlu是是LPro的前体的前体图图1 1微生物界糖代谢中间产物及氨基酸之间的转化关系微生物界糖代谢中间产物及氨基酸之间的转化关系2、发酵法的基本过程、发酵法的基本过程 基本过程基本过程 培养基培养基配制与灭菌处理菌种菌种诱变与选育菌种培养、灭菌及接种发酵产品提取及分离纯化工业发酵培养基工业发酵培养基中碳源：淀粉水中碳源：淀粉水解糖、糖蜜、甘解糖、糖蜜、甘薯粉等薯粉等氮

24、源一般为硫酸铵、氮源一般为硫酸铵、尿素或豆饼水解液尿素或豆饼水解液AaAa生产菌种主要生产菌种主要为细菌，其次是为细菌，其次是酵母菌酵母菌1)1)野生型野生型2)2)诱变菌株诱变菌株3)3)杂种菌株杂种菌株 4)4)基因工程菌基因工程菌平板或斜面培养平板或斜面培养种子培养种子培养发酵培养发酵培养产谷氨酸棒状杆菌产谷氨酸棒状杆菌, ,短杆菌短杆菌产缬氨酸棒状杆菌突变株产缬氨酸棒状杆菌突变株AS1.586AS1.586北京棒状杆菌和钝齿棒状杆菌原生质体融合北京棒状杆菌和钝齿棒状杆菌原生质体融合苏氨酸苏氨酸, ,色氨酸工程菌已工业化色氨酸工程菌已工业化 氨基酸发酵方式：氨基酸发酵方式： 液体通风深层

25、培养法液体通风深层培养法 摇瓶培养摇瓶培养发酵罐发酵罐 种子罐培养种子罐培养菌种筛选菌种筛选 （二）发酵法生产的氨基酸品种及工艺（二）发酵法生产的氨基酸品种及工艺 绝大部分氨基酸均可通过发酵法生产绝大部分氨基酸均可通过发酵法生产 发酵法生产发酵法生产Aa存在的问题：存在的问题： 产物浓度低，设备投资大，工艺管理要求严格，生产物浓度低，设备投资大，工艺管理要求严格，生产周期长，成本高。产周期长，成本高。1、L-异亮氨酸（异亮氨酸（L-Isoleucine，L-Ile）的制备）的制备（1） 结构与性质：结构与性质：外观：外观：菱形叶片状或片状晶体（乙醇中）菱形叶片状或片状晶体（乙醇中） 溶解性：溶

26、解性：L-Ile溶于热醋酸，溶于热醋酸，20乙醇中溶解度为乙醇中溶解度为0.072，25水中为水中为4.12，75水中为水中为6.08，不溶于乙醚。，不溶于乙醚。 （2 2）工艺路线）工艺路线菌种培养：菌种培养：一级种子培养（斜面一级种子培养（斜面摇瓶摇瓶,30,30,16h,16h）二级种子培养（接种量二级种子培养（接种量3.53.5，8h)8h)接种：接种：5m5m3 3发酵罐发酵罐, ,发酵液装量发酵液装量3 3吨，接种量吨，接种量1 1，发酵条件：发酵条件：180rpm, 180rpm, 通气量通气量0.2vvm0.2vvm，30-3130-31,60h60h过滤：发酵液加热至过滤：发

27、酵液加热至100100，维持，维持10min,10min,冷却过滤（冷却过滤（1 1），），滤液，调滤液，调pH3.5pH3.5，过滤（，过滤（2 2）去沉淀）去沉淀纯化：纯化：H+H+732732阳离子交换法，滤液流速阳离子交换法，滤液流速: :树脂量的树脂量的1.51.5/min/min洗涤：用洗涤：用100L100L去离子水洗脱：用去离子水洗脱：用6060，0.5mol/0.5mol/氨水氨水3L/min3L/min洗脱洗脱（3 3）工艺过程）工艺过程 菌种培养菌种培养 种子培养基种子培养基 一级种子培养基一级种子培养基（%）：葡萄糖）：葡萄糖 2 尿素尿素 0.3 玉米浆玉米浆 2.5

28、 豆饼水解液豆饼水解液0.1（以干豆饼计）（以干豆饼计） pH6.5。 二级种子培养基二级种子培养基：另加：另加菜籽油菜籽油0.4，其余同一级种子培养，其余同一级种子培养基。基。 一级种子培养一级种子培养：1000ml三角瓶中培养基装量为三角瓶中培养基装量为200ml，接种斜面接种斜面AS1.998菌种，菌种，30培养培养,16h。 二级种子培养二级种子培养：接种量：接种量3.5，培养，培养8h，如此逐级放，如此逐级放大培养得足够量菌种。大培养得足够量菌种。一级种子培养(摇瓶）一级种子罐扩大培养（二级发酵）二级种子罐扩大培养（三级发酵）种子罐接种方式：（1）降压法将茄子瓶接种针插入接种口，降低

29、种子罐压力，菌悬液自动从茄子瓶注入种子罐（2）火焰封口接种法种子罐接种口周围设有沟槽，接种前向其中注入少量酒精，用火点燃，在接种口形成一圈火焰，在火焰圈中将种子液倒入即可二级种子培养（种子罐） 灭菌、发酵灭菌、发酵 发酵培养液组成发酵培养液组成（% %）: : 硫酸铵硫酸铵 4.5 4.5 豆饼水解液豆饼水解液 0.40.4，玉米浆，玉米浆 2.0 2.0 碳酸钙碳酸钙 4.5 pH7.24.5 pH7.2，淀粉水解还原，淀粉水解还原糖初糖浓度糖初糖浓度 11.511.5。 灭菌：灭菌：118118120120，1.11.110105 5PaPa压力，压力，30min30min，立即，立即通冰

30、盐水冷却至通冰盐水冷却至2525。 注意培养基的优化注意培养基的优化Response surface methodology (RSM)Response surface methodology (RSM)响应面法响应面法(Response Surface Methodology, RSM) (Response Surface Methodology, RSM) 是一种寻找多因素系统是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法，也称回归设计。它能有效地结合数学方法和统中最佳条件的数学统计方法，也称回归设计。它能有效地结合数学方法和统计分析，以最经济的方式，用很少的实验数量和时间对实验进行全面研究

31、，计分析，以最经济的方式，用很少的实验数量和时间对实验进行全面研究，定向地优化响应因子定向地优化响应因子 Y = A0 + Ai Xi + AiiXii 2+ AijXiXj 发酵：发酵： 接种量：接种量：1，180rpm，3031，通气量：，通气量：0.2L（minL）, 发酵发酵60h，在，在2450h之间不断补加尿素之间不断补加尿素至至0.6，氨水至，氨水至0.27。工业发酵罐接种方式：工业发酵罐接种方式：通过装有阀门（隔膜通过装有阀门（隔膜阀或球心阀）的接种阀或球心阀）的接种管道接种，种子罐压管道接种，种子罐压力力 发酵罐压力发酵罐压力0.05MP0.05MP以上，利用压以上，利用压差

32、将种子液输入发酵差将种子液输入发酵罐罐注意发酵条件的优注意发酵条件的优化化 除菌体、酸化除菌体、酸化 发酵液加热至发酵液加热至100100并维持并维持10min10min，冷却过滤，冷却过滤滤液加工业硫酸和草酸至滤液加工业硫酸和草酸至pH3.5pH3.5，过滤除沉淀。，过滤除沉淀。等电点沉等电点沉淀淀预处理：预处理：热沉淀热沉淀 离子交换、吸附分离离子交换、吸附分离 吸附：吸附：H H十十- -型型732732离子交换树脂柱（离子交换树脂柱（4040100cm100cm）洗涤：水洗洗涤：水洗洗脱：洗脱：6060、0.5mol0.5molL L氨水，分部收集洗脱液。氨水，分部收集洗脱液。离子交换

33、树脂柱离子交换树脂柱三、酶转化法三、酶转化法 (掌握）掌握） （一）基本原理及过程（一）基本原理及过程 原理原理：在：在特定酶特定酶的作用下使某些化合物转化成相应氨基酸的作用下使某些化合物转化成相应氨基酸（即利用酶或细胞作为催化剂实现化学转化的过程）即利用酶或细胞作为催化剂实现化学转化的过程） 过程过程： 氨基酸前体氨基酸前体相应底物相应底物固定化酶固定化酶或细胞或细胞AaAa反应液反应液分离纯化分离纯化AaAa成品成品反应器反应器 酶转化法与直接发酵法的异同：酶转化法与直接发酵法的异同： 本质相同本质相同，都是利用，都是利用酶催化化学反应酶催化化学反应 过程不同过程不同： 酶转化法为酶转化法

34、为单酶或多酶的高密度转化单酶或多酶的高密度转化（反应过程反应过程） 发酵为发酵为多酶低密度转化多酶低密度转化（生命过程生命过程） 酶转化法的优点：酶转化法的优点： 工艺简单，产物浓度高，转化率及生产效率较高，工艺简单，产物浓度高，转化率及生产效率较高，副产物少。固定化酶或细胞可进行连续操作，节省副产物少。固定化酶或细胞可进行连续操作，节省能源和劳务，并可长期反复使用。能源和劳务，并可长期反复使用。（二）酶转化法生产的氨基酸品种及工艺（二）酶转化法生产的氨基酸品种及工艺 目前酶催化法生产的氨基酸已达目前酶催化法生产的氨基酸已达10多多种：种： 酶催化的合成法酶催化的合成法：延胡羧酸延胡羧酸+ +

35、铵盐铵盐L-L-天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸酶天冬氨酸酶L-L-天冬氨酸天冬氨酸L-L-丙氨酸丙氨酸天冬氨酸天冬氨酸- -脱羧脱羧酶酶L-L-精氨酸精氨酸L-L-瓜氨酸瓜氨酸精氨酸脱亚胺酶精氨酸脱亚胺酶吲哚吲哚+L-+L-丝氨酸丝氨酸L-L-色氨酸色氨酸色氨酸合成酶色氨酸合成酶甘氨酸甘氨酸+ +甲醇甲醇L-L-丝氨酸丝氨酸丝氨酸转羟丝氨酸转羟甲基酶甲基酶甘氨酸甘氨酸+ +乙醛乙醛L-L-苏氨酸苏氨酸苏氨酸醛苏氨酸醛缩酶缩酶酶催化的手性拆分法：酶催化的手性拆分法：可拆分的外消旋体可拆分的外消旋体AaAa: : DL-DL-蛋氨酸、蛋氨酸、DL-DL-缬氨酸、缬氨酸、DL-DL-苯丙氨酸、苯丙氨酸、D

36、L-DL-色氨酸、色氨酸、DL-DL-丙氨酸及丙氨酸及DL-DL-苏氨酸等苏氨酸等拆分用酶拆分用酶: :氨基酰化酶氨基酰化酶1、L-天冬氨酸及天冬氨酸及L-丙氨酸的制备丙氨酸的制备 （1 1） 结构与性质结构与性质 L天冬氨酸（天冬氨酸（L-Aspartic acid，Asp）的结构与性）的结构与性质质 化学名：化学名：-氨基丁二酸或氨基琥珀酸氨基丁二酸或氨基琥珀酸外观：外观：纯品为白色菱形叶片状结晶纯品为白色菱形叶片状结晶 溶解性溶解性：溶于水及盐酸，不溶于乙醇及乙醚。：溶于水及盐酸，不溶于乙醇及乙醚。 等电点等电点:2.77，熔点熔点:269271。旋光性旋光性：在碱溶液中左旋，在酸性液中

37、为右旋：在碱溶液中左旋，在酸性液中为右旋25D = +5.05（C0.52.0，在水中），在水中） 25D= +25.4（C0.52.0，在，在5molL HCl中）。中）。 酸性酸性AaAa理化性质理化性质 L-丙氨酸（丙氨酸（L-Alanine，简称，简称L-Ala）的结构与性质）的结构与性质 菱形结晶（水和乙醇）菱形结晶（水和乙醇）等电点等电点: :6.0，中性氨基酸中性氨基酸溶解性：溶解性： 易溶于水，微溶于乙醇，不溶于丙酮及乙醚。易溶于水，微溶于乙醇，不溶于丙酮及乙醚。旋光性：旋光性： 2525D D =+18 =+18（C C0.50.52.02.0，在水中），在水中） 2525D

38、 D= =14.614.6(C(C0.50.52.02.0，在，在5mol/L HCl5mol/L HCl中）中） （2 2）L-AspL-Asp和和L-AlaL-Ala的酶转化反应的酶转化反应 L-AlaL-AlaL-ASPL-ASP（3 3）工艺路线）工艺路线（4 4）工艺过程）工艺过程 酶的制备酶的制备天冬氨酸酶的发酵生产天冬氨酸酶的发酵生产菌种：菌种：大肠杆菌（大肠杆菌（Esscherichia coli）AS1.881L-天冬氨酸天冬氨酸-脱羧酶的发酵生产脱羧酶的发酵生产菌种：德阿昆哈假单胞菌菌种：德阿昆哈假单胞菌68变异株变异株上述两种酶为胞内酶上述两种酶为胞内酶 发酵培发酵培养液

39、养液调调pH5.0pH5.04545保温保温1h,1h,室温室温含天冬氨酸酶的菌体含天冬氨酸酶的菌体100010002000L2000L一级种子一级种子发酵法生产天冬氨酸酶的过程：发酵法生产天冬氨酸酶的过程：扩培发酵新鲜斜面发酵培发酵培养液养液调调pH4.75pH4.753030保温保温1h,1h,含含L-L-天冬氨酸天冬氨酸-脱羧酶的菌体脱羧酶的菌体100010002000L2000L一级种子一级种子30 30 8h 8h二级种子二级种子30 30 24h 24hL-L-天冬氨酸天冬氨酸-脱羧酶的发酵生产脱羧酶的发酵生产发酵发酵细胞固定细胞固定 Ecoli（含含天冬氨酸酶）天冬氨酸酶）的细胞

40、固定的细胞固定 1212明胶，明胶， 1 1戊二醛戊二醛 含含L-天冬氨酸天冬氨酸-脱羧酶假单胞菌的固定化脱羧酶假单胞菌的固定化 45 45 5 5角叉菜胶，戊二醛角叉菜胶，戊二醛, , 生物反应堆的制备生物反应堆的制备 生物反应堆生物反应堆1：将含天冬氨酸酶的固定化将含天冬氨酸酶的固定化Ecoli装填于填装填于填充床式反应器（充床式反应器（40200cm ）. 生物反应堆生物反应堆2：将含将含L-天冬氨酸天冬氨酸-脱羧酶固定化假单胞脱羧酶固定化假单胞菌装填于耐受菌装填于耐受1.515105Pa压力的填充床式反应器压力的填充床式反应器（30180cm）填充床反应器填充床反应器转化反应转化反应

41、延胡索酸铵底物延胡索酸铵底物溶液溶液(37 pH8.5)pH8.5)生物反应堆生物反应堆1 1转化液转化液L-AspL-Asp转化率转化率9595磷酸吡哆醛磷酸吡哆醛pH6.0pH6.037 37 生物反应堆生物反应堆2 2转化率转化率9595连续流连续流 转化液转化液L-AlaL-Ala分离分离L-L-天冬氨酸天冬氨酸- -脱羧酶脱羧酶 产品纯化与精制产品纯化与精制 L-AspL-Asp转化液转化液滤液滤液过滤过滤调调pH2.8pH2.855结晶过夜结晶过夜过滤过滤结晶结晶冷水洗涤冷水洗涤抽干抽干105105干燥干燥L-AspL-Asp粗品粗品稀氨水溶解稀氨水溶解活性炭脱色活性炭脱色滤液过滤

42、过滤55结晶过夜结晶过夜过滤过滤结晶结晶真空干燥真空干燥药用药用L-Asp L-Asp L-AlaL-Ala的纯化与精制略的纯化与精制略（5）作用与用途）作用与用途 用于治疗慢性肝炎、肝硬化及高血氨症。同时用于治疗慢性肝炎、肝硬化及高血氨症。同时L-Asp和和L-Ala都是复合氨基酸输液的原料。都是复合氨基酸输液的原料。 2.酶拆分法制备酶拆分法制备L-苯丙氨酸（苯丙氨酸（L-phenylalanine，L-phe） （1）结构与性质）结构与性质 必需氨基酸必需氨基酸外观外观: :白色叶片状晶体，无臭，微苦白色叶片状晶体，无臭，微苦pIpI为为5.485.48；溶解性：溶解性：在在2525水中

43、溶解度为水中溶解度为2.962.96，在，在7575水中为水中为6.626.62，微溶于甲醇及乙醇，不溶于乙醚。，微溶于甲醇及乙醇，不溶于乙醚。旋光性：旋光性：2525D D-4.47-4.47( (在在5mol/L HCl5mol/L HCl中）中）2525D D-34.5-34.5（在水中）（在水中）（2）酶拆分）酶拆分DL-Phe的原理（的原理（a-d）：）：掌握掌握* a. 乙酰化乙酰化DL-Phe +醋酸酐醋酸酐乙酰乙酰-DL-Phe（Ac-DL-Phe） b. 立体选择性水解立体选择性水解氨基酰化酶氨基酰化酶可专一性水解可专一性水解Ac-L-Phe的酰胺键生成的酰胺键生成L-Phe

44、，而不水解，而不水解Ac-D-Phe的酰胺键的酰胺键 Ac-L-PheAc-L-Phec. 分离分离利用利用L-Phe与与Ac-D-Phe在水中在水中溶解度的差异溶解度的差异进行分离。进行分离。 d. 劣对映体的消旋化及再水解劣对映体的消旋化及再水解Ac-D-Phe可经可经消旋化消旋化生成生成Ac-DL-Phe，再行水解和分，再行水解和分离，如此反复进行，可将离，如此反复进行，可将DL-Phe全部转化为全部转化为L-Phe。（3 3）工艺路线）工艺路线 （4 4）工艺过程）工艺过程 固定化氨基酰化酶的制备固定化氨基酰化酶的制备 载体：载体：DEAE-Sephadex A-50 酶的固定化：酶的

45、固定化： 按比例与载体混合按比例与载体混合搅拌吸附搅拌吸附过滤过滤洗涤洗涤固定固定化酶化酶 Ac-DL-Phe的制备的制备 DL-PheDL-Phe 冰醋酸冰醋酸醋酸酐醋酸酐171171，wvv9090，4 45h5h浓缩浓缩液浓缩液冷却、结冷却、结晶晶6060真空干燥真空干燥AcAcDLDLPhePhe乙酰化反乙酰化反应应反应液反应液 酶水解酶水解 1000L1000L反应反应罐罐水解反应水解反应700L 0.1mol/L700L 0.1mol/LAc-DL-PheAc-DL-Phe钠盐溶液钠盐溶液6mol/L6mol/LH HClCl搅拌下滴加搅拌下滴加151520kg20kg固定固定化氨

46、基酰化酶化氨基酰化酶5050pH6.7pH6.77.07.04 45 5h h过滤滤液滤液待分离待分离L LPhePhe 分离纯化分离纯化 转化转化后滤液后滤液6mol/L HCl6mol/L HCl调调pHpH至至4.8-5.14.8-5.1减压浓缩减压浓缩35L35L浓缩液浓缩液结晶结晶过滤过滤洗涤洗涤10L10L冷乙醇冷乙醇抽干抽干烘烘干干L LPhePhe粗品粗品滤液滤液洗涤液洗涤液AC-D-PheAC-D-Phe80803-4h3-4h0 0浓缩浓缩 精制精制 LPhe粗品溶解粗品溶解活性炭脱色活性炭脱色趁热过滤趁热过滤滤液结晶滤液结晶滤取结晶滤取结晶冷乙醇冷乙醇洗涤洗涤干燥干燥 L

47、Phe晶体晶体重结重结晶晶药用药用L- Pheo AcAcD DPhePhe的消旋化的消旋化 浓缩浓缩醋酸酐酰化醋酸酐酰化浓盐酸调浓盐酸调pH pH 结晶结晶 AcAcDLDLPhePhe （5）作用与用途）作用与用途 a. L-Phe为复合氨基注射液的重要原料之一为复合氨基注射液的重要原料之一 b.合成苯丙氨酸氮芥及对氟苯丙氨酸等抗癌药的原料。合成苯丙氨酸氮芥及对氟苯丙氨酸等抗癌药的原料。四、化学合成法四、化学合成法 （一）基本原理与过程（一）基本原理与过程 原料原料:-卤代羧酸、醛类、甘氨酸衍生物、异氰酸盐卤代羧酸、醛类、甘氨酸衍生物、异氰酸盐等等反应过程反应过程：氨解、水解、缩合、取代及

48、氢化还原等化：氨解、水解、缩合、取代及氢化还原等化学反应学反应 化学合成法的分类化学合成法的分类 一般合成法一般合成法：卤代酸水解法、氰胺水解法、乙酰氨基丙二酸二乙酯卤代酸水解法、氰胺水解法、乙酰氨基丙二酸二乙酯法等；产物均为法等；产物均为DL-型氨基酸混合物。型氨基酸混合物。 不对称合成法不对称合成法：直接合成、直接合成、-酮酸反应及不对称催化加氢等方法。酮酸反应及不对称催化加氢等方法。产物为产物为L-型氨基酸。型氨基酸。 （二）化学合成法生产的氨基酸品种及工艺（二）化学合成法生产的氨基酸品种及工艺 理论上理论上所有氨基酸皆可由化学合成法制造所有氨基酸皆可由化学合成法制造但只有当采用其它方法生产很不经济时才采用化学合但只有当采用其它方法生产很不经济时才采用化学合成法生产，如甘氨酸、成法生产，如甘氨酸、DL-蛋氨酸及蛋氨酸及DL-丙氨酸等丙氨酸等 对于氨基酸来说，化学合成并不是首选方法对于氨基酸来说，化学合成并不是首选方法发酵法和酶催化法是氨基酸的主要生产方法发酵法和酶催化法是氨基酸的主要生产方法1、L-脯氨酸（脯氨酸（L-Proline，L-Pro）的制备）的制备 （1）结构与性质）结构与性质 来源来源：存